淫羊藿苷通过影响MAPK信号通路抑制oxLDL诱导血管平滑肌细胞增殖作用研究.docVIP

淫羊藿苷通过影响MAPK信号通路抑制oxLDL诱导血管平滑肌细胞增殖作用研究 　　[摘要] 研究淫羊藿苷（ICA）对氧化低密度脂蛋白（oxLDL）诱导血管平滑肌细胞（VSMC）增殖的抑制作用，以及对增殖细胞核抗原（PCNA）表达和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的影响。以oxLDL（50 mg?L-1）诱导VSMC增殖，采用MTT法检测ICA对oxLDL诱导VSMC增殖的抑制作用；Realtime PCR和Western blot方法检测ICA对oxLDL诱导增殖VSMC内细胞周期相关蛋白PCNA基因及蛋白表达的影响；Western blot方法检测ICA对oxLDL诱导增殖VSMC内p38MAPK，ERK1/2，JNK信号通路相关信号蛋白磷酸化的影响。结果显示，经oxLDL（50 mg?L-1）刺激后，VSMC增殖活性显著增强，细胞存活率显著提升，S期、G2/M期细胞显著增加，G0/G1期细胞显著减少；同时，PCNA基因及蛋白表达水平显著提升；不同浓度的ICA（40，20，10 μmol?L-1）可显著抑制oxLDL诱导的VSMC增殖，减少S期、G2/M期细胞，增加G0/G1期细胞，降低oxLDL诱导的PCNA基因及蛋白的表达水平，下调oxLDL诱导的pp38和pERK1/2蛋白的表达，但不影响pJNK蛋白的表达。上述结果表明，ICA对oxLDL诱导的VSMC增殖具有抑制作用，可能通过降低PCNA表达和阻断p38MAPK和ERK1/2信号通路抑制VSMC增殖。 　　[关键词] 淫羊藿苷； 血管平滑肌细胞； 增殖细胞核抗原； MAPK信号通路； 细胞周期 　　血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）是血管壁的重要构成部分，亦是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）斑块中最主要的细胞成分，其异常增殖、迁移和分泌在AS发生、发展中起着关键作用[1]。有研究显示[2]，oxLDL是促进VSMC增殖的重要物质，其可通过激活细胞内多种信号传导通路、刺激多种生物分子的表达，引起VSMC增殖。因此，对与细胞增殖机制相关的信号通路进行阻断，干扰促增殖生物分子的表达，可有效抑制VSMC增殖、控制AS斑块形成及进一步发展。 　　淫羊藿苷（icariin，ICA）是从小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.的干燥叶中提取的一种黄酮类化合物，是中药淫羊藿的主要活性成分之一[3]。近年来，国内外学者对ICA的研究较为活跃，多集中于抗骨质疏松、抗炎、抗肿瘤和免疫调节等药效方面[4]，但有关ICA抗AS作用及相关机制的研究较少。本研究探讨ICA对VSMC增殖的影响，并围绕MAPK信号通路研究其机制，旨在为ICA在防治AS性心血管疾病中的应用提供实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞株 人主动脉VSMC细胞株购于中国科学院上海细胞库，由吉林大学药理与实验毒理学教研室保存。 　　1.2 试药与仪器 ICA（四川维克奇生物技术有限公司，纯度98.0%）；oxLDL（广州奕源生物科技有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，北京鼎国昌盛公司）；DMEM培养基（美国Thermo Fisher Scientific公司）；胎牛血清（天津灏洋生物制品公司）；MTT（美国Sigma公司）；ERK1/2抗体，pERK1/2抗体（美国SAB公司）；PCNA抗体，p38抗体，pp38抗体，JNK抗体，pJNK抗体，GAPDH抗体（中杉金桥）；BCA蛋白测定试剂盒（南京凯基生物有限公司）；化学发光液和硝酸纤维素膜（密理博中国有限公司）；Trizol（美国Invitrogen公司）；TransScript Ⅱ Green TwoStep qRTPCR SuperMix（北京全式金公司）；倒置显微镜（日本Olympus公司）；DG5031型酶联免疫检测仪（南京华东电子集团医疗装备有限责任公司）。 　　1.3 细胞培养 从液氮中取出VSMC置37 ℃水浴中，迅速解冻。用吸管转入装有10 mL DMEM低糖培养液（含10%胎牛血清）的培养瓶内，轻轻摇匀，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养，用3～6代细胞进行实验。 　　1.4 oxLDL诱导VSMC增殖 用MTT法测定。将生长良好、处于对数期的VSMC接种于96孔细胞培养板，待细胞贴壁后更换无血清DMEM低糖培养液继续培养过夜，使细胞同步化于G0期，然后分别加不同浓度的oxLDL，使oxLDL终浓度分别为0，10，25，50，100，200 mg?L-1。培养24 h后，加入5 g?L-1MTT 20 μL，继续培养4 h，吸弃培养液，加入DMSO 150 μL，震荡10 min后测定570 nm波长处吸光度（A），计算细胞