甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体构建及其转化烟草研究.docVIP

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体构建及其转化烟草研究 　　摘　要：用限制性内切酶从目的基因供体质粒pBI－aPG上切下大小约2.3 kb的目的基因，将它定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上，构建成含有GUS基因和NPTⅡ基因的甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体pCB－aPG。采用直接转化法将pCB－aPG导人根癌农杆菌菌株LBA4404，采用该菌株对普通烟草进行了遗传转化研究。在Kanamycin选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株，经过GUS基因组织化学法检测以及PCR方法鉴定，证实了该反义基因已导人烟草基因组中。此项研究为下一阶段用该反义基因转化甜瓜品种以改良甜瓜果实耐贮运性打下基础。 　　关键词：甜瓜；PG；反义基因；植物表达载体 　　中图分类号：S652　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2007)04-492-04 　　 　　在全世界大宗水果的排名中，甜瓜居于第九位，是全世界普遍栽培的、经济价值很高的重要园艺作物。然而大多数甜瓜属于呼吸跃变型果实，达到生理成熟的甜瓜果实采收后会很快出现呼吸高峰，果肉迅速变软，商品性和贮运性大大降低。据统计，新疆哈密瓜在销售地的短期贮藏损失达15％，甘肃黄河密甜瓜运销过程中的损耗高达29.3％。这给种植者和经营者都带来了重大的经济损失。也在一定程度上影响了甜瓜产业的发展。 　　 　　甜瓜果实的成熟软化与果胶的降解有重要的关系。多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)是一种细胞壁结合蛋白，可以催化果胶分子中a-1，4-聚半乳糖醛酸的裂解，参与果胶的降解，使细胞壁结构解体，导致果实软化。构建PG反义基因植物表达载体，通过基因工程手段导入植物体内，可以大幅度降低PG含量，在一定程度上缓解果实软化．达到耐贮运的目的。在番茄上已有报道，并具有良好的商业化前景。在甜瓜中，未见类似报道。我们在前期研究工作中克隆到一个甜瓜PG基因，作者的目的就是构建其反义基因植物表达载体并转化模式植物烟草以验证该植物表达载体的可用性，以期为下一阶段转化甜瓜，改善其贮运性奠定一定的理论基础。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1　材料 　　质粒pBI-aPG、pCAMBIA2301、大肠杆菌菌株DH5ct和农杆菌LBA4404由本实验室保存。各种限制性内切酶、DNA marker购自上海生工公司；CIP、T4DNA连接酶购自Promege公司。 　　 　　1．2　重组质粒的构建 　　 　　用限制性内切酶EcoR I和HindⅢ从目的基因供体pBI-aPG上切下3端加有CaMV35S启动子和5′端加有NOS终止子的PG反义嵌合基因35Sp-aPG-NOSt(约2.3 kb)，将其插到相同酶切并进行磷酸化的线性pCAMBIA2301质粒载体上，从而构建成植物表达载体pCB-aPG(图1)。 　　 　　1．3　重组质粒的筛选及鉴定 　　提取质粒DNA，进行电泳滞后带检测。从电泳产生滞后带的重组质粒中随机挑取重组质粒进行PCR鉴定。对PCR鉴定呈阳性的质粒进行双酶切鉴定，将构建好的该反义基因植物表达载体命名为pCB-aPG。 　　 　　1．4　pCB-aPG转化烟草 　　采用直接转化法将pCB-aPG导入农杆菌LBA4404t81。提取质粒翻，进行PCR扩增鉴定。烟草的转化采取叶盘法，对经抗生素筛选且在生根培养基上长出的完整植株进行GUS活性检测，并对其进行分子鉴定。 　　 　　2　结果与分析 　　 　　2．1 DCB-aPG植物表达载体的构建 　　 　　将回收的DBI-aPG小片段和载体pCAMBIA2301进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态，取250 txL连接产物涂在附加有75 mg／LKana的LB琼脂平板上，37℃过夜培养后，平板上生长15个白色的单菌落。而对照(以ddH2O替代连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态)平板上没有长出菌落。 　　随机挑取处理平板上的单菌落进行电泳滞后带鉴定，用pCAMBIA2301质粒DNA做对照(图2)。结果表明，随机挑取的4个菌落的电泳带均比对照滞后。取滞后带质粒为模板，用特异性引物对其进行PCR鉴定，结果表明(图3)，重组质粒PCR可以获得约1200 bp的电泳条带，与预期带大小一样。随机挑取一个PCR阳性质粒进行EcoR I和HindⅢ双酶切．切下了大小约2.3 kb的预期片段。同时，对挑取的质粒进行Xba I和Sac I双酶切，也切下了预期大小为1.2 kh的片段(图4)。通过上述几种方法检测，证明目的片段已经整合进载体质粒中，命名重组质粒为pCB―aPG。 　　 　　2．2　重组质粒pCB-aPG转化农杆菌 　　采用直接转化法，用重组