环介导等温扩增技术及其在鸭病病原检测中应用研究进展.docVIP

环介导等温扩增技术及其在鸭病病原检测中应用研究进展 　　摘 要：环介导等温扩增（LAMP）技术是一门新兴的分子生物学检测技术，因其具有特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便和成本低等特点，越来越受到兽医相关工作者的关注。目前，该方法己被广泛应用各种动物病原的检测。本文综述了LAMP 技术在鸭传染病病原检测中的应用研究进展情况，以期为今后鸭病的诊断和防控工作提供参考。 　　关键词：LAMP；鸭病；病原；检测；应用 　　中图分类号：S818.9 文献标识码：A 文章编号：1673-1085（2016）04-0043-06 　　鸭传染病对养鸭业的威胁时刻存在，目前养殖场主要是将病料送专业检测实验室进行病原分离鉴定或PCR检测，一旦出现疫情，由于条件所限，很难实现对疫病的快速检测。日本学者Notomi 等[1]开发了一种新型核酸扩增技术，即环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，该技术不需要模板的热变性[2]、长时间温度循环、繁琐的电泳和紫外观察等过程，整个反应在恒温条件下进行，反应结束后，结果可用肉眼直接观察[3]，在疫病诊断领域显示了广阔的应用前景，本文就LAMP技术及其在鸭病病原检测中的应用研究进展综述如下。 　　1 LAMP技术 　　1.1 LAMP扩增原理 LAMP技术是针对靶基因6个区域设计4条特殊引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在65℃左右温度下，启动循环链置换反应，完成对目标DNA的大量扩增。在LAMP反应中，内引物杂交在目标DNA区，启动互补链合成，导致哑铃状DNA产生。这种结构很快以自身为板，进行DNA合成延伸，形成茎-环DNA结构，然后以此结构作为LAMP循环的起始结构。由于内引物杂交在茎-环的环上，引物链置换合成的DNA产生一个有缺口的茎-环DNA中间媒介，在茎上附有目标序列。再通过外引物，在茎的末端形成环状结构，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。 　　1.2 LAMP引物设计 首先在靶基因的3末端设定F3c、F2c、F1c三个区段，在5末端设定B1、B2、B3三个区段。针对这六个区段设计四条引物，包括一对内部引物和一对外部引物。上游内部引物FIP：在3末端含有与F2c互补的F2区段，在5末端含有与F1c相同序列的区段下游内部引物BIP：在3末端含有与B2c互补的B2区段，在5末端含有与B1c相同序列的区段。上游外部引物F3：含有与目标DNA上的F3序列相同的区段。下游外部引物B3：含有与目标DNA的B3相同序列的区段，各引物组成及对应区域如下图1所示。 　　[图1 LAMP的引物组成及对应区域] 　　引物的设计要注意以下几个问题：①扩增领域为F2～B2区段间，应该在200bp以内；②包含F2/B2在内的环状部分的长度在40～60bp范围内；③各区段的Tm值应该在60～65℃之间；④若只是为了鉴定靶基因存在与否，F1～B1的间距可以为零；⑤引物应避免二次结构发生；⑥各引物的3端不可含有与其他引物互补的序列。 　　1.3 LAMP技术特点 LAMP技术特点具有以下特点：①操作简便、耗时短、成本低，扩增反应在等温下持续进行，只需在恒温水浴锅中几十分钟即可完成，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性，适合在基层养殖场的推广应用；②扩增的效率高，没有PCR反应中温模板的退火、复性过程，在15～60min内可扩增109～1010倍，能满足临床病料样本快速检测的需要；③特异性高，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。针对六个区段使用四种不同的引物，可特异性扩增靶基因序列；④灵敏度高，检测的敏感性是常规PCR的10倍，扩增模板可达10拷贝或更少；⑤仅使用一种链置换型BstDNA聚合酶，因BstDNA聚合酶是一种不耐热的DNA聚合酶，因此必须在模板预变性以后再加样；⑥扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不一的结构；⑦当模板是RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样进行扩增。 　　1.4 反应产物的检测 LAMP反应产物的检测方法主要有五种：①以2%的琼脂糖凝胶电泳观察是否有典型的梯状条带泳判定结果；②以扩增产生的副产物焦磷酸镁白色沉淀的产生用肉眼直接判断扩增反应是否进行；③反应体系中加入溴化乙锭、SYBR Green Ⅰ等染料，通过观察扩增结果是否产生相应颜色来判定是否有目的片段扩增；④通过恒温扩增微流控芯片实时观察反应结果；⑤运用实时浊度仪监测反应结果。 　　2 在鸭病毒病检测中的应用 　　2.1 鸭病毒性肝炎病毒检测 鸭病毒性肝炎是由鸭病毒性肝炎病毒（DHV）引起的一种急