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甜瓜属REMAP分子标记体系建立及应用 　　摘要：基于甜瓜属Ty1-copra类逆转座子的长末端重复序列信息，结合ISSR引物序列，在体系优化的基础上建立了适用于甜瓜属物种的REMAP(retrotransposon-一microsatellite amplified polymorphism)标记体系。对46份甜瓜属不同类型材料进行聚类分析，证明该标记体系能有效检测甜瓜属不同类型材料问的多态性，可以用于甜瓜属作物品种鉴定及指纹图谱构建。 　　关键词：甜瓜属；分子标记；REMAP；多态性 　　 　　逆转座子(retrotrarsposon)是高等植物中种类最多、分布最广的一类可移动因子，其转座过程以RNA为中间媒介，通过逆转录酶所主导的DNA-RNA-DNA方式转座，每转座1次，其拷贝数就增加1次，从而成为植物基因组的重要组成部分。根据是否具有长末端重复序列(long terminal repeat，LTR)可将其分为LTR和非LTR两类。目前研究较多的是LTR类逆转座子，是一类异质性很高的群体，以高拷贝数形式出现，广泛存在于所有染色体中，在植物中表现出插入多态性。 　　逆转座子因具有分布广泛、高度异质性及拷贝数多等特性，使其成为研究植物遗传多样性和进化的理想工具。逆转座子微卫星多态性标记(retro-transposon-microsatellite amplified polymorphism，REMAP)是基于逆转座子LTR序列并结合ISSR开发的应用比较广泛的标记之一。已有研究表明REMAP标记具有谱带丰富、多态性高以及操作简便等优点，在品种鉴定和遗传多样性分析方面具有广泛的应用价值。 　　甜瓜属包含甜瓜(Cucumis melo IJJ)和黄瓜(C.sativus L.)2种重要经济作物，但其遗传基础狭窄，黄瓜栽培种间的多态性仅为3％-9％，进一步开发多种分子标记体系对于促进甜瓜属植物基因组研究具有重要意义。笔者前期研究发现逆转座子在黄瓜的基因组中分布广泛，并且开发了SSAP标记。虽然SSAP标记能够有效地揭示甜瓜属不同材料间的遗传多样性，但是该标记体系基于酶切和PCR技术，对DNA质量要求较高，且操作步骤繁琐，在一定程度上限制了其应用㈣。因此，进一步开发多态性高、操作简单的标记体系具有重要意义。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1.1　材料 　　选取来自不同地区、不同生态型的46份甜瓜属材料，其中包括黄瓜近缘野生种C，hystrix及其与栽培黄瓜北京截头杂交加倍后形成的异源四倍体新种C.hytivus(表1)。所用材料均为本实验室多年自交保存资源。 　　 　　 　　1.2　方法 　　1.2.1　基因组DNA提取供试植株统一播种于温室中，待植株长至第5片真叶时，取刚展开的新叶，采用CTAB法提取基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭显色进行DNA浓度定量。 　　1.2.2　REMAP引物的设计与合成　REMAP标记体系的正、反向引物分别来源于Tyl-copia类逆转座子的LTR序列和ISSR引物，其中Tyl-copia类逆转座子序列信息来源于GenBank，登录号为GQ326556，引物序列信息见表2。引物由上海英骏生物有限公司合成。 　　1.2.3　REMAP反应体系的建立前期通过调整反应体系中DNA模板量、Taq酶、Mg2+、dNTPs和引物等各成分的比例，优化扩增体系。确定REMAP标记的反应体系为：20μL反应体系中，10xbuffel-2.0mmol?L-1、Mg2+2.0 mmol?L-1、dNTPs 0.2 mmol-L-1、Tao酶1.0 U、0.4 txm01，L-1引物，模板DNA 50 ngPCR扩增反应在PTC-100 PCR仪上进行，扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2 min.40个循环；循环结束后72℃延伸10min，4℃终止反应。 　　1.2.4　PCR产物检测　1μL上样缓冲液与6μL。PCR产物混合后，在2％琼脂糖凝胶上以1xTAE缓冲液进行电泳，EB染色，在凝胶成像系统中采集图像。1μL上样缓冲液和3μLPCR产物混匀后，6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检测。 　　1.2.5　聚类分析对REMAP引物检测结果分析，每条多态性条带为1个数据统计条带，并采用1(有带)和0(无带)的方法统计条带，最后用NTSYSpc2.11软件进行分析作图。 　　 　　2　结果与分析 　　 　　2.1　REMAP聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 　　图1显示。46份甜瓜属材料中共扩增出33条条带，其中23份黄瓜材料扩增出22条条带，其中14条为共有条带，差异率为36.36％。这22条条带大多集中于100-