热补针法对寒证类风湿关节炎模型家兔滑膜组织代谢物影响.docVIP

热补针法对寒证类风湿关节炎模型家兔滑膜组织代谢物影响 　　摘要：目的 通过测定寒证类风湿关节炎（RA）模型家兔滑膜组织内源性代谢物，探讨热补针法治疗RA的特异性机制。方法 采用卵蛋白诱导联合低温冷冻法复制寒证RA模型。将40只清洁级青紫蓝家兔随机分为正常组、模型组、平补平泻组、捻转补法组、热补针法组，每组8只。除正常组和模型组外，其余各组分别施以平补平泻、捻转补法、热补针法针刺“足三里”，1次/d，留针30 min，连续7 d。干预结束后分离家兔膝关节滑膜组织，应用气相色谱-四级杆飞行时间质谱采集各组滑膜代谢物谱图，利用主成分分析和偏最小二乘判别分析对数据进行统计。结果 与正常组比较，模型组家兔滑膜组织代谢物变化主要体现于三羧酸循环、糖类及脂肪酸代谢相关物质增高（P0.05）；与模型组比较，各针刺组家兔滑膜组织代谢物变化主要体现于上述各种代谢相关物质降低（P0.05），且热补针法组三羧酸循环与糖代谢相关物质明显低于平补平泻组和捻转补法组（P0.05）。结论 热补针法治疗RA的特异性体现在对三羧酸循环及糖代谢通路的调控。 　　关键词：热补针法；类风湿关节炎；滑膜组织；代谢组学；气相色谱-质谱法；兔 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.015 　　中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）02-0055-05 　　类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以滑膜炎为主的慢性自身免疫性疾病，该病病程迁延、反复发作，对患者的生活造成严重影响。针灸疗法具有抗炎、免疫调节等作用[1-3]，对RA具有确切的临床疗效[4-5]。热补针法是郑魁山教授简化烧山火手法和进火法而形成的一种复式手法，具有补益正气、温阳散寒之功用。课题组前期研究表明，热补针法治疗RA在镇痛方面具有相对特异性[6-9]，但这些初步研究尚不能体现针灸多靶点、多途径、多层次、类似于网络结构的作用特点，缺乏对针刺后机体产生的全部生物信息的综合分析。 　　代谢组学是一门新兴的系统生物学，通过考察生物体系在外因刺激下其代谢路径及代谢产物的变化，从系统生物学角度研究机体发病及治疗机制的新技术[10-11]。该研究手段的优势与针灸作用特点甚相吻合。为了进一步深入研究热补针法治疗RA的特异性机制，课题组前期以寒证RA模型家兔为载体，对家兔尿液内源性代谢物进行了分析[12]。本实验进一步观察热补针法干预对家兔模型关节滑膜组织代谢物的影响，从系统生物学角度探讨热补针法治疗RA的特异性机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物 　　2～3月龄清洁级健康青紫蓝家兔40只，雌雄各半，体质量（2.5±0.5）kg，兰州生物制品研究所，动物许可证号SCXK（甘）2012-0001。饲养于温度（20±2）℃，相对湿度（50±10）%，每日光照时间12 h，自由进食饮水。 　　1.2 针具、主要试剂与仪器 　　针灸针（华成牌，苏州东邦医疗器械有限公司）。卵蛋白干粉（批号A5253-250G）、弗氏完全佐剂（批号F5881），Sigma公司。甲醇、吡啶，国药集团；尿素酶、甲氧胺盐酸吡，Sigma公司。Agilent GC/MS系统、毛细管色谱柱，JW Scientific公司。 　　1.3 分组及造模 　　家兔适应性饲养7 d，随机分为正常组、模型组、平补平泻组、捻转补法组、热补针法组，每组8只。采用卵蛋白诱导联合低温冷冻进行RA寒证模型复制[13-14]。实验正式开始前3 d，剃去家兔背部肩胛骨间的毛。将4 mg/mL卵蛋白溶液与等量弗氏完全佐剂混匀，充分震荡成乳化剂，2%碘酒、75%乙醇消毒肩背部均匀选定的6个点，每点皮下注射0.2 mL。14 d后以相同方式、相同剂量重复皮下注射1次。第2次免疫后6 d，剃去家兔双后腿膝关节周围的毛，2%碘酒、75%乙醇消毒双膝关节，关节内注入20 mg/mL卵蛋白生理盐水溶液0.4 mL。24 h内膝关节出现红肿触痛，表明模型复制成功。成模后第2日，乙醇消毒两后腿足，上、下、左、右围置冰袋，温度降至-20～-25 ℃冷冻1.5 h，45 ℃温水复温5 min。冷冻后14 d，家兔表现为精神萎靡不振，两后肢匍伏跛行，膝关节肿胀、周径明显大于正常组，局部青紫、皮温不高，表示成功建立RA寒证模型。 　　1.4 针刺方法 　　先将家兔固定，选取后腿“足三里”[15]。各针刺组分别施以相应针法。热补针法操作参照《郑氏针灸全集》[16]：左手拇指紧按穴位，右手持针刺入穴内8～12 mm，针刺得气后，左手加重压力，右手拇指向前连续捻按5次；针下沉紧后针尖拉着有感应的部位，连续重插轻提5次；拇指再向前连续捻按5次，反?筒僮?1 min；最后使针下