独活寄生汤含药血清对退变软骨细胞表达miRNA―140影响.docVIP

独活寄生汤含药血清对退变软骨细胞表达miRNA―140影响 　　【摘 要】目的：观察独活寄生汤含药血清对体外培养的大鼠退变软骨细胞表达miRNA-140的影响，探讨独活寄生汤防治骨关节炎的作用机制。方法：4周龄SD大鼠膝关节软骨建立体外培养的软骨细胞，采用Ⅱ型胶原原位杂交法对第3代（F3）软骨细胞进行鉴定。用10 ng?mL-1白细胞介素-1β诱导F3软骨细胞，复制退变软骨细胞模型。成功后随机分为模型组和独活寄生汤含药血清组，分别在培养24，48，72 h后采用TaqMan real-time PCR法检测各组miRNA-140表达。结果：独活寄生汤含药血清组 　　miRNA-140相对表达量随着干预时间的延长逐渐增加，差异有统计学意义（P 0.05）。结论：独活寄生汤治疗骨关节炎的部分作用机制是有效促进退变软骨细胞miRNA-140的表达。 　　【关键词】 骨关节炎；独活寄生汤；含药血清；软骨细胞；miRNA-140 　　骨关节炎（osteoarthritis，OA）属中医学“痿证”“痹证”“骨痹”范畴，肝肾亏虚致其虚为病之内因，风寒湿邪致其痹为病之外因，故本质为本虚标实、本痿标痹[1]。独活寄生汤出自唐?孙思邈《备急千金要方》，具有扶正祛邪、标本兼顾的特点，能针对OA的病因病机起治疗作用，能有效缓解膝OA的临床症状[2-3]。实验研究发现，独活寄生汤能有效促进软骨细胞增殖[4-5]，抑制软骨细胞凋亡[6]，延缓软骨退变[7]，但其作用机制尚未完全明确。本实验通过观察独活寄生汤含药血清对白细胞介素（IL）-1β诱导的退变软骨细胞表达miRNA-140的影响，进一步探讨独活寄生汤治疗OA的作用机制。 　　1 实验材料 　　1.1 实验药物 独活寄生汤由独活9 g，桑寄生、秦艽、杜仲、防风各6 g等组成，由福建中医药大学附属第二人民医院药剂科提供。使用时用蒸馏水1 L，煎煮2次，每次煎1 h，将2次药液合并，浓缩成1 g?mL-1，保存在-20 ℃冰箱中，备用。 　　1.2 实验动物 2月龄清洁级雄性SD大鼠24只，体质量（250±10）g；4周龄SD大鼠10只，体质量（100±10）g，均购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK（沪）2012-0002。福建中医药大学实验动物中心具备清洁级医学实验动物环境设施，许可证号：SYXK（闽）2014-0006。 　　1.3 试剂和仪器 胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）；IL-1β细胞因子（美国Peprotech公司）；DMEM低糖培养基（美国Hyclone公司）；兔抗大鼠Ⅱ型胶原抗体，大鼠IgG二抗，免疫组化试剂盒（北京中杉金桥试剂公司）；提取试剂盒mirVana? miRNA Isolation Kit（美国Thermo Scientific公司）；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific公司）；TaqMan实时荧光定量PCR试剂，探针标记的miRNA-140（引物系列：CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG）、U6（引物系列：AGCCTCAAGATCATCAGCAATGCCTC）及PCR mastermix（美国Invitrogen公司）；ABI 7500实时荧光 　　定量PCR仪（Applied Biosystems公司）；二氧化碳培养箱（Heraeus公司）；荧光倒置显微镜（徕卡仪器公司）；超净工作台（北京东联哈尔仪器公司）。 　　2 方 法 　　2.1 独活寄生汤含药血清的制备 根据随机数字表法将24只2月龄SD大鼠随机分为空白血清组与含药血清组，每组12只。给药剂量参照药理实验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[8]，含药血清组大鼠给予4.65 g?kg-1?d-1独活寄生汤灌胃，早晚各1次；空白血清组大鼠给予每日 　　2次4.65 mL?kg-1?d-1生理盐水灌胃。连续灌胃7 d，最后一天连续2次灌胃，中间间隔2 h。采血前禁食12 h，2 h后在质量分数为10%水合氯醛麻醉下腹主动脉采血。将所得全血在37 ℃恒温水浴箱中静置30 min后，离心机3000 r?min-1离心15 min，取上清于56 ℃水浴锅中灭活30 min，0.22 μm一次性针头滤器过滤，-20 ℃保存备用。 　　2.2 软骨细胞的培养 将4周龄SD大鼠，用体积分数为750 mL?L-1的乙醇浸泡后，分离双侧膝关节，带入无菌操作台，取胫骨平台和股骨下端的软骨，剪成1 mm3大小，转移入盛有质量分数为0.2%Ⅱ型胶原酶的培养瓶，37 ℃恒温水浴摇床上消化2 h，取上清液，200目尼龙网筛?^滤，离心机1000 r?min-1离心5 min，收集细胞