番茄黄化曲叶病毒Rep基因植物表达载体构建及对番茄遗传转化.docVIP

番茄黄化曲叶病毒Rep基因植物表达载体构建及对番茄遗传转化 　　摘要：克隆番茄黄化曲叶病毒的复制酶基因（TYLCV-Rep），并构建其植物表达载体，通过农杆菌介导法转入番茄子叶外植体。经过共培养、潮霉素筛选和分化再生，获得21株潮霉素抗性植株。PCR检测和Southern Blot检测结果表明，有3株呈阳性检测反应，说明TYLCV-Rep基因已整合到番茄基因组中，阳性率为14.3%。烟粉虱接种试验结果表明，番茄转基因植株较非转基因植株对番茄黄化曲叶病毒的抗性明显增强。 　　关键词：复制酶基因；黄化曲叶病毒；番茄；遗传转化；表达载体 　　中图分类号：S436.412.1+1 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0041-04 　　收稿日期：2014-03-19 　　基金项目：国家大宗蔬菜产业技术体系建设专项（编号：CARS-25）；山东省高等学校科技计划 （编号：J07WG06、J09LC59、J10LC73、J12LE56）；潍坊科技学院校级课题（编号：W13K029、W13K033、W13K051）；山东半岛蓝色工程研究院科研计划（编号：sdlgy2013y014）。 　　作者简介：裴华丽（1978―），女，山东潍坊人，硕士，讲师，主要从事蔬菜分子育种研究。E-mail：peihuali2@163.com。 　　通信作者：刘永光，硕士，讲师，主要从事植物病理方面的研究。E-mail：ygliu425@163.com。番茄在中国各蔬菜产区均有大面积的种植，在我国蔬菜周年供应中占有非常重要的地位。随着温室大棚的推广及蔬菜反季节栽培效益的提高，温室番茄栽培面积连年增长，其病害的发生也呈现逐步加重的趋势。近年来，在番茄主产区相继发现的番茄黄化曲叶病毒，对番茄植株的生长、开花、坐果等方面均产生严重的危害，给当地的番茄生产带来巨大的经济损失[1-6]。番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）属双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）[4-7]，是一类世界范围内广泛发生的单链环状DNA病毒。自1986年首次将烟草花叶病毒（ TMV） 外壳蛋白（ coat protein，CP） 基因导入烟草培育出抗TMV植株以来，利用病毒本身的基因导入植物获得抗病毒植株已成为抗病毒基因工程的重要手段。在番茄转基因抗病毒育种中，主要利用病毒的外壳蛋白基因和复制相关蛋白（replication-associated protein，Rep）基因。 　　复制酶是指由病毒编码的，能特异合成病毒正负链RNA的RNA聚合酶，其核心功能是合成全长的病毒基因组RNA。在病毒编码的复制酶组分中存在多个保守序列，这些序列对聚合酶的活性必不可少[8]。自1990年Golemboski等将TMV U1株编码的复制酶的一部分基因序列转入烟草中，得到了高抗的烟草植株[9]以来，人们已对许多病毒的复制酶基因介导的抗病性及其抗性机制开展了深入研究[10-13]。但利用转番茄黄化曲叶病毒的复制酶基因来获得番茄抗黄化曲叶病毒的实例还未见报道。本研究从番茄黄化曲叶病毒株中克隆黄化曲叶病毒的复制酶基因，并将其转入番茄中以期获得抗番茄黄化曲叶病毒植株，从根本上解决当前番茄普遍存在的病害问题，尽快培育出适合山东乃至国内主要番茄种植区的抗番茄黄化曲叶病毒株系，以满足目前番茄产业的需求。 　　1材料与方法 　　1.1材料与试剂 　　1.1.1植物材料植物受体番茄品种菜都六号购于山东省寿光市金田种苗有限公司。TYLCV病毒样品采自山东省寿光市，番茄植株上部卷曲黄化及矮缩等具有感染番茄黄花曲叶病毒典型症状的叶片。 　　1.1.2菌株与试剂限制性内切酶BglⅡ、Eco 911、T4-DNA连接酶、DNA Marker均购自MBI公司，Taq DNA聚合酶、碱性磷酸酶购自宝生物工程有限公司，植物基因组DNA提取试剂盒、凝胶快速纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒等均购自北京全式金公司。植物表达载体pCAMBIA1304、农杆菌LBA4404由山东农业大学竺晓平老师惠赠。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、BL21由笔者所在实验室保存。琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、头孢霉素（Cef）、潮霉素（Hyg）、乙酰丁香酮（AS）、利福平（Rif）、链霉素（Str）、6-苄氨基嘌呤（6-BA）、3-吲哚乙酸（IAA）均购自Sigma公司，其他试剂为国产分析纯。引物均由北京华大基因科技有限公司合成，其序列如表1所示。 　　1.1.3培养基基本培养基为MS培养基，各培养基附加蔗糖30 g/L、琼脂7.5 g/L，pH值调至5.