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疣蝗肠道好氧细菌分离及ARDRA多态性分析 　　摘要：将疣蝗中肠样品倍比稀释后涂布平板分离菌株，共分离得到11株好氧细菌。以细菌基因组DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物（27f，1492r）对模板扩增，并用4种限制性内切酶HaeⅢ 和 HindⅢ、HinfⅠ和TaqⅠ对PCR扩增产物进行ARDRA多态性分析。对聚类图谱的分析结果发现，11株好氧细菌在 82%的水平上聚成 3个不同分类操作单元（OTU），表明疣蝗肠道内好氧细菌的遗传多样性水平偏低。 　　关键词：肠道细菌，多样性，ARDRA，疣蝗 　　 　　疣蝗 Trilophidia annulata （Thunberg）隶属直翅目（Orthoptera）斑翅蝗科（Oedipodidae）疣蝗属（Stal），在我国只有疣蝗一个种[1]，作为一种农业害虫广泛分布在吉林、海南、云南、陕西、贵州等省，主要危害苜蓿、水稻、甘蔗、橡胶苗和多种蔬菜，是一个广布种。2005年海南蝗灾大爆发，虫口密度有时高达2 500头/m2以上，水稻和甘蔗遭受巨大损失[2]。???前蝗虫主要采用天敌、化学农药和绿僵菌等防治措施，环境污染严重，效果受天气影响较大。因此大力开发稳定性较好的生物农药非常必要。 　　昆虫肠道中存在的微生物菌群与昆虫的营养、免疫等生理活动密切相关[3]。肠道微生物的改变直接影响昆虫的进食、生长发育，因此近年来，动物肠道微生态的研究已成为热点。有研究表明，利用肠道微生物的改变能够提高家蚕、日本龟蜡蚧等昆虫的经济价值[4，5]。关于蝗虫肠道微生物的研究目前仅见于东亚飞蝗肠道细菌的鉴定[6，7]，而疣蝗肠道微生物的研究尚未见报道。 　　本研究通过涂布平板法，从疣蝗肠道中分离出可培养好氧细菌，研究疣蝗肠道内好氧细菌的多样性，为研究蝗虫与肠道微生物的关系提供科学依据；为后期利用肠道弱势菌群饲喂疣蝗，改变其肠菌多样性，影响其生长发育、杀虫等提供种质资源，以期开发出新的杀虫效力稳定的生物杀菌剂。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1昆虫样品 　　采自西南林业大学树木园内的健康疣蝗（Trilophidia annulata） 　　1.2培养基与试剂 　　平板分离纯化培养基：营养肉汤培养基；纯化培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 　　细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR试剂、限制性内切酶等购自TIANGEN公司 　　1.3细菌的分离和纯化 　　将疣蝗仅用无菌水饲养3d，排尽其肠道食物。剪掉翅膀和足，将虫体于升汞溶液中浸泡5min，期间用镊子翻动虫体，使消毒彻底。再用无菌水冲洗虫体5min，重复3次。在无菌条件下解剖疣蝗取中肠，研磨捣碎后加1ml无菌水制成肠道匀浆悬液，备用。将肠道匀浆液按1×(10-1~10-8)用无菌水倍比稀释，各取1ml涂布于营养肉汤平板上，置于28℃培养箱中培养7d。挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线纯化。纯菌株于4℃斜面保藏。所有数据重复3次。 　　1.4菌体总DNA提取 　　用细菌基因组DNA提取试剂盒提取好氧细菌单菌落的基因组DNA。 　　1.516S rDNA扩增 　　以16S rRNA的通用引物进行PCR扩增。正向引物27f（5`-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3`）和反向引物1492r（5`-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3`）。反应体系：10×PCR Buffer 5μl，MgCl2 3μl，dNTP 1μl，引物各1μl，DNA模板1μl，Taq酶（5U/μl）0.5μl，无菌水补足50μl。反应条件：94℃预变性5min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 3min，30个循环，72℃最终延伸5min。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。 　　1.6ARDRA分析 　　用两组4种限制性内切酶对16S rRNA基因扩增产物进行酶切。 　　1.6.1HaeⅢ 和 HindⅢ的酶切 　　反应体系：HaeⅢ 1μl；Hind 1μl；10×M Buffer 2μl；DNA 10μl; 灭菌水补足20μl。反应条件：37℃过夜，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。 　　1.6.2HinfⅠ和TaqⅠ的酶切 　　反应体系：HinfⅠ1μl；TaqⅠ1μl；10×TaqⅠBasal Buffer 2μl；0.10%BSA 2μl；DNA 10μl；灭菌水补足20μl。反应条件：37℃ 2~3h，65℃ 2h，0.80%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。 　　1.6.3多态性分析 　　用软件labimage2.0将琼脂糖凝胶上出现的DNA带谱转化为分子量信息，按“出现”记为1，“不出现”记为0，进行统计。模糊条带及分子量小于80bp的条带忽略不计。根据条