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羊大肠埃希菌灭活苗微囊化制剂研究 　　摘要：以海藻酸钠为包被材料，采用喷雾干燥法对羊大肠埃希菌灭活苗进行微囊化包被，以包埋率、平均粒径作为评价指标，通过单因素试验结合正交试验对微囊配方及工艺进行优化。结果表明，壁材浓度2%，芯材与壁材比例 1 ∶3，保护剂含量4%，乳化剂含量6%，进风温度200 ℃，出风温度90 ℃，蠕动泵速率70 mL/h，均质速率16 000 r/min时，所得产品粒径为（5.08±2.75） μm，包埋率达到75.23%，效果最佳。同时对产品进行体外释放试验，结果表明，所制备的微胶囊产品在人工胃液中2 h内未完全溶解，可抵御胃酸，具有肠溶性。 　　关键词：微胶囊；大肠埃希菌；海藻酸钠；包埋 　　中图分类号：R944.5；S858.265.1+2文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）01-0177-03 　　收稿日期：2013-05-31 　　作者简介：杨力伟（1984―），男，新疆昌吉人，硕士，主要从事动物疾病防治工作。E-mail。疫苗是预防和控制传染病的一种重要手段，我国研制的羊大肠埃希菌灭活苗是福尔马林和氢氧化铝苗，已用于生产，所采用的方法为注射法，具有良好的预防效果。但在使用中，注射过程往往会给动物造成较大应激，使动物生产性能下降，甚至因为操作或护理不当，引起动物死亡，造成较大的经济损失。 　　微胶囊[1]产品作为一种新型药物剂型广泛应用于口服疫苗给药中。口服疫苗[2]通过饮水或采食对动物进行预防接种，具有安全易行、实用方便、省时省力等优点，但是由于反刍动物消化道的复杂性，其强大的瘤胃微生物消化功能使得常规口服制剂若不经特殊处理，会在消化道内被降解而减弱或失去效果。因此，本研究致力于开发羊大肠埃希菌疫苗新剂型改变传统注射剂型，使免疫接种途径更加简单快捷，从而为开发反刍动物用大肠埃希菌口服疫苗奠定理论和实践基础。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　1.1.1菌株C83-1、C83-2、C83-3菌株，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。 　　1.1.2试验动物健康昆明白小鼠，购自新疆医科大学医学实验动物中心。 　　1.1.3试验试剂麦康凯琼脂（上海市医学化验所试剂厂），海藻酸钠（天津市光复精细化工研究所），胃蛋白酶（上海蓝季科技发展有限公司），吐温80（天津市盛淼精细化工有限公司），BCA蛋白测定试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。 　　1.1.4试验仪器PL2002电子天平[梅勒特-托利多仪器（上海）有限公司]，ST-98B摇床（北京桑翌试验仪器研究所）、HG-76-6电热恒温两用箱（湖南省长沙市西区起重电器厂），MM-I型微量振荡器（江苏省姜堰市健华医疗器械有限公司），YC-015试验型喷雾干燥机（上海雅程仪器设备有限公司），KHB ST-360 全自动酶标仪。 　　1.2试验方法 　　1.2.1大肠埃希菌灭活苗的制备 　　菌株的复苏取适量3种冻干粉，分别接种于普通肉汤培养基中，37 ℃恒温摇床130 r/min培养24 h。 　　菌株的复壮取复苏菌液腹腔注射小鼠，待其死亡后，无菌剖取肝脏涂布于麦康凯培养基上，37 ℃培养24 h，伊红美蓝培养基划线分纯2代，革兰氏染色，镜检。纯化后挑取单个菌落接种于普通肉汤培养基中，作为种子菌备用。 　　菌种保存纯化镜检后，挑取单个菌落接种于半固体培养基中，37 ℃培养24 h，无菌甘油封存，于4 ℃保存备用。 　　制苗用菌液制备将C83-1、C83-2、C83-3种子菌混合，按一定量接种于2%蛋白胨肉汤37 ℃恒温摇床中130 r/min培养24 h。 　　菌液灭活检验按菌液总量的0.3%～0.45%加入甲醛溶液，经37 ℃灭活48 h，吸取一定量灭活菌液，接种于普通琼脂培养基上，37 ℃培养48 h，无菌生长。 　　菌落计数吸取一定量的菌液以0.22 μm滤膜过滤除菌水作倍比稀释，于血细胞计数器上菌落计数。 　　配苗经计数后，调整菌液含菌量作为羊大肠埃希菌灭活苗。 　　1.2.2羊大肠埃希菌的微囊化 　　微囊化工艺流程取适量的羊大肠埃希菌灭活苗加入一定浓度的壁材溶液中，乳化均质，进行喷雾干燥，冷却，收集产品。 　　壁材溶液配制海藻酸钠磁力搅拌溶解过夜、高压（115 ℃，10 min）备用。 　　乳化均质海藻酸钠、乳化剂、保护剂及灭活抗原组织捣碎机高速乳化10 min，于均质机上A挡（10 000 r/min）保温均质30 min。 　　喷雾干燥将乳状液置于喷雾干燥机内，进行喷雾干燥。 　　微囊包被配方筛选通过单因素正交试验确定试验4个影响因素：壁材溶液浓度、芯材与壁材的比例、保护剂含量以及乳化剂含量。采用L9（34）正交表设计配方正交试验因素水平