竹节参总皂苷通过NF―κB 通路对LPS致RAW264.7细胞炎症保护作用研究.docVIP

竹节参总皂苷通过NF―κB 通路对LPS致RAW264.7细胞炎症保护作用研究 　　[摘要] 目的：探讨竹节参总皂苷对脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬细胞的抗炎作用。方法：噻唑蓝（MTT）法检测不同浓度的竹节参总皂苷对RAW264.7细胞活性的影响；一氧化氮（NO）试剂盒法检测竹节参总皂苷对LPS刺激RAW264.7细胞的NO释放量；酶联免疫吸附法（ELISA）检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素1-β（IL-1β）分泌；逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS），TNF-α，IL-1β mRNA的表达；免疫印迹法（Western blot）检测胞核内核转录因子-κB p65（NF-κB p65）蛋白表达。结果：竹节参总皂苷的安全用药范围为≤80 mg?L-1；与LPS模型组相比，竹节参总皂苷各剂量组（0.1，1，10，40 mg?L-1）均能显著降低LPS刺激下RAW264.7细胞NO，TNF-α和IL-1β分泌；竹节参总皂苷各剂量组（10，40 mg?L-1）均能抑制iNOS，TNF-α，IL-1β mRNA表达和NF-κB p65蛋白表达。结论：初步证实了竹节参总皂苷对LPS致RAW264.7巨噬细胞炎症的保护作用，作用机制可能与 NF-κB通路有关。 　　[关键词] 竹节参总皂苷；小鼠巨噬细胞系；脂多糖；抗炎 　　[收稿日期] 2013-11-06 　　[基金项目] 国家自然科学基金项目81374001）；湖北省自然科学基金创新群体项目（2013CFA014） 　　[通信作者] 王婷，副教授，Tel：（0717）6397466，E-mail：tingting0301@126.com 　　[作者简介] 代艳文，硕士研究生，E-mail：dyw891122@163.com 　　炎症是一种非常常见而又十分重要的基本病理过程，其伴随着很多疾病的发生和发展，同时又会加重疾病的发展，有些甚至会产生恶性肿瘤。在炎症分子机制的研究中，已发现多条重要的信号通路，基于这些重要的炎症信号通路中的关键分子筛选抗炎药物受到广泛关注。竹节参是我国名贵中草药，竹节参总皂苷是从竹节参块根中提取分离而得，是竹节参的主要活性成分。竹节参总皂苷主要包括人参皂苷Re、竹节参皂苷V、竹节参皂苷Ⅳ、竹节参皂苷Ⅳa、竹节参皂苷2等。竹节参的药理研究显示，竹节参及其活性成分具有抗炎、镇痛等多种药理作用[1-3]。基于此，本研究建立LPS致小鼠巨噬细胞系RAW264.7炎症模型，初步探讨竹节参总皂苷的抗炎效果，为竹节参的开发和利用提供理论基础。 　　1 材料 　　1.1 药物提取配制 竹节参的块根是在湖北恩施椿木营竹节参种植基地采集，由湖北省天然产物研究与开发重点实验室邹坤教授鉴定为五加科人参属植物竹节参Panax japonicus C. A. Mey。竹节参总皂苷（total saponins of P. japonicus，TPSJ）是由本研究团队提取分离，其提取分离方法参照前期研究基础[4]，提取率为18.4%，纯度83.48%[5]。实验前用PBS溶解配成质量浓度为1 000 mg?L-1的母液，再用培养基稀释至所需质量浓度。 　　1.2 试剂 DMEM高糖培养基（Gbico，884684）；胎牛血清（杭州四季清公司，100607）；LPS B5：O55（Sigma公司，110M4086V）；Trizol，DEPC，PCR扩增试剂盒（上海生工生物工程有限公司，A7107-1，SJ0312B4013J）；PrimeScriPt RT reagent Kit With gDNA Eraser（大连宝生物工程有限公司，BK401）；一氧化氮检测试剂盒（碧云天生物公司，S0021-3）；TNF-α，IL-lβ ELISA试剂盒（上海欣博盛生物科技有限公司，M121015-12a和M121029-07a）；NF-κB抗体（Cell Signaling Technology，L8F6）；MTT（武汉博士德生物公司，AR1156）；ECL试剂盒（武汉科瑞生物有限公司，P1010）；BCA蛋白定量试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司，P1511）；β-actin，iNOS，TNF-α，IL-1β引物由上海生工合成，引物序列如下：β-actin上游5′-CGTGCGTGACATCAAAGAGAA-3′，下游5′-TGGATGCCACAGGATTCCAT-3′；iNOS上游5′-GCCCTGCTTTGTGCGAAG-3′，下游5′-GCCCTTTGTGCTGGGAGTC-3′；TNF-α上游5′-AGGCAACCTGACCACTCTCC-3′，下游5′-CACCACCATCA