红肉脐橙等5个柑橘品种气孔器结构比较研究.docVIP

红肉脐橙等5个柑橘品种气孔器结构比较研究 　　摘要：以卡拉卡拉红肉脐橙、玫瑰橙、稻叶温州蜜柑、春见和HB柚等的春梢嫩叶(1/2伸展)与完全伸展叶片为材料，结合常规石蜡切片、超薄切片与透射电镜技术、扫描电镜技术以及改良的临时装片法，对3种柑橘属植物5个品种叶片的显微结构及气孔器进行了观察，并运用气孔器长度、宽度，副卫细胞数目等变量对气孔器进行了聚类分析。结果表明，参试柑橘品种叶片气孔主要分布在下表皮，在上表皮中仅在中脉附近呈带状分布：参试品种的气孔结构基本类似，气孔横切面呈“漏斗”状，内开口决定气孔的开张程度；5个品种的气孔器均可以明显地分为2种类型(Ⅰ-型与Ⅱ-型)，2类气孔器在气孔外开口长度与宽度、气孔内开口长度与宽度、气孔器大小以及副卫细胞的数目方面均存在显著差异，并且2者的分化时期与发育命运各不相同；橙类叶片发育后期Ⅰ-型气孔器的退化可能与其抗病性的提高有关。 　　关键词：柑橘；气孔器；保卫细胞；副卫细胞；分类 　　中图分类号：S666.4　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2011)02-193-06 　　气孔是植物与外界环境进行气体、水分交换的通道，与光合作用、呼吸作用和蒸腾作用关系密切。植物的气孔密度、大小及开闭规律与其对环境的适应性、抗性有密切的关系。也是种质资源评价中重要的植物学性状之一。 　　目前，国内外系统研究柑橘叶片气孔的报道甚少，研究柑橘类植物气孔的方法主要有煮沸撕取法和扫描电镜法。柑橘类植物的叶片质地结构紧密，采用撕取法操作难度大、效率极低，而幼嫩叶片细胞经解离后变得松散无法撕取下表皮，因而煮沸撕取法很难取得成功；此外，柑橘类植物叶片表面具有蜡质，采用透明胶带黏取法无法撕取下表皮；印迹法程序复杂，且不易制片成功；而扫描电镜法对仪器设备要求高，从而影响了柑橘类植物气孔的研究。 　　研究表明，柑橘溃疡病病原菌主要通过气孔和机械伤口进入植物组织，进而引起一系列的病理反应。李润唐等在对30个柑橘类植物气孔研究中发现，柑橘气孔口存在内脊。温寿星等在对几个柑橘品种的叶片结构与柑橘溃疡病抗性的初步研究后推测气孔的内部构??可能与品种的抗性有关。但限于上述研究方法存在的各种弊端，目前未见有柑橘气孔内部构造的深入研究报道。因此，探究适合柑橘类植物的表皮与气孔的简易观察方法，系统深入研究柑橘类植物的气孔器结构，是柑橘植物学研究中的一项重要内容，对柑橘类植物的抗逆性机制研究及品种定向选育具有重要意义。 　　 　　1、材料和方法 　　 　　1.1材料 　　试验材料为卡拉卡拉红肉脐橙、玫瑰橙、稻叶温州蜜柑、春见和HB柚等5个柑橘品种春梢嫩叶(1/2伸展)与完全伸展(未完全转绿)叶片，取自福建省农业科学院果树研究所柑橘种质资源圃。为减小试验误差，5个品种统一时间取材，取材时间为9：00-10：00 AM。 　　1.2柑橘气孔器结构观察 　　常规石蜡切片：将叶片剪成约5mm×5mm，于Carnoy’s固定液中固定24h－70％酒精漂洗－2％丙酸酒精媒染－爱氏苏木精整染3-5d－自来水返蓝24h－系列酒精脱水－5级二甲苯透明－石蜡包埋－5-8μm连续切片－中性树脂封片－OlympusBX-41荧光显微镜镜检(530-550nm激发自发荧光)。 　　超薄切片制作：叶片剪成3mm×1mm.3％戊二醛-1.5％多聚甲醛4℃前固定3h.1％锇酸-1.5％亚铁氰化钾后固定1.5h，pH7.2PBS漂洗；70％酒精饱和醋酸铀染液4℃过夜，酒精一丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋剂包埋；Leica EM UC6切片机进行超薄切片，切片厚度90nm，JEM-100CXⅡ透射电镜观察。 　　扫描电镜样制备参照李润唐等的方法，处理后的样品用JSM-6380LV扫描电镜观察。 　　1.3表皮细胞结构观察与气孔器分类 　　叶片剪成约0.5cm×0.5cm，迅速置于Carnoy’s固定液(甲醇：冰醋酸＝3：1)中固定至完全褪绿，ddH2O漂洗去除残余固定液，3mol?L-1NaOH溶液中(60℃水浴)处理2-3min(材料变成透明状)，ddH2O漂洗5遍。将处理材料置于载玻片上并滴加I2-KI溶液染色30s，盖玻片装片后于Olympus BX-41显微镜镜检摄像。各品种随机观察气孔约50个。图像由Photoshop 7.0图像处理软件进行数值转换，记录气孔器大小(即保卫细胞长度、宽度)、气孔长度、宽度，副卫细胞数目等。数据用SPSS 16.0软件进行统计分析。 　　 　　2、结果与分析 　　 　　2.1柑橘气孔器结构 　　显微结构观察结果表明，参试5个柑橘品种的气孔结构基本类似：其气孔器向外突出；保卫细胞外表面外累积蜡质角质层并形成长椭圆形外开口，而保卫细胞内壁产生特异性加厚，形成一个狭缝形内开口；气孔