管式磁性微粒子化学发光免疫分析法测定人尿液中雌三醇.docVIP

管式磁性微粒子化学发光免疫分析法测定人尿液中雌三醇 　　摘 要待测尿液中的雌三醇、辣根过氧化物酶标记的雌三醇与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的兔抗雌三醇抗体在均相体系中发生竞争性免疫反应，再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒，反应生成物结合在磁微粒上，在磁场中经分离、洗涤后加发光底物，检测发光强度（RLU），测定尿液中雌三醇的含量。通过对检测条件的优化，建立了磁性微粒子化学发光免疫分析法测定人尿液中雌三醇的方法，并对正常男性、女性和孕妇的尿液中雌三醇含量进行了测定。结果表明，本方法的线性范围为1～100 SymbolmA@ g/L，检出限为0.25 SymbolmA@ g/L，具有很高的灵敏度; 批内相对标准偏差＜14%; 批间相对标准偏差＜7%，具有良好的稳定性和重现性。 　　关键词 雌三醇; 化学发光免疫分析; 磁性微粒子; 尿液 　　 　　1 引 言 　　雌三醇（Estriol, E3）是重要的内源性雌性激素之一。人???内存在游离雌三醇和结合雌三醇，男性及未孕女性体内的雌三醇含量很低。正常孕龄女性体内雌三醇的主要来源是雌二醇和雌酮的代谢产物；孕妇体内雌三醇的主要来源是婴儿和胎盘，且含量一般较高。通过检测孕妇血清或尿液中雌三醇的含量，可以判断胎儿的发育状况。因此，快速、准确地检测血清或尿液中雌三醇的含量对于科研和临床应用都具有重要意义。目前，检测游离雌三醇或总雌三醇的常用方法有高效液相色谱法（HPLC）[1,2]、液相色谱-质谱（LC-MS）法[3]、酶联免疫分析法（ELISA）[4]、放射免疫法（RIA）[5～7]、时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）[8]和化学发光免疫分析法（CLIA）[9～11]等。本实验应用化学发光免疫分析法（CLIA）高灵敏度和高特异性的特点，利用磁性微粒子的分离特性，快速、准确地对人体尿液中的雌三醇含量进行了化学发光免疫检测。 　　雌三醇（E3）是一种半抗原小分子，有免疫反应性。实验中采用竞争法对尿液中的雌三醇进行分析，使待测雌三醇、辣根过氧化物酶标记的雌三醇（E3-HRP）在均相体系中与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的兔抗雌三醇抗体（FITC-E3抗体）发生竞争性免疫反应。再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒，反应生成物结合在磁微粒上，在磁场中经分离、洗涤后加发光底物，用冷光分析仪检测发光强度（RLU），测定尿液中雌三醇的含量。检测原理如图1所示。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　Flash′n glow LB955 30管全自动进样冷光分析仪（Berthold公司）；高速离心机（Beckman公司），实验中分离温度为4和25 ℃，转速13000 r/min；磁性分离器（北京科美东雅生物技术有限公司定制，磁场强度2800 Gs）；XW80旋涡混合器（上海精科实业有限公司）；试管12×60 mm（浙江拱东医用塑料厂）；磁性微粒子（磁性分离剂，Adaltis公司）。 　　雌三醇标准品（Sigma公司）；兔抗E3抗血清、羊抗FITC抗体包被的磁性微粒子（5 g/L）、FITC标记的兔抗雌三醇抗体、HRP标记的E3抗原、发光底物及PBST洗涤液，均由北京科美东雅生物技术有限公司提供；其它试剂均为分析纯。标准品稀释液为50 mmol/L PBS缓冲溶液（pH＝7.4，含2.0% BSA及0??5%水解明胶，0.1% Proclin）。 　　图1 尿液中雌三醇的检测原理 　　Fig．1 Principle of determination of estriol in human urine 　　2.2 实验步骤 　　2.2.1 PBS-BSA缓冲液、E3标准溶液、E3-HRP溶液、FITC-E3抗体溶液的配制PBS-BSA缓冲液的配制：用50 mmol/L KH??2PO??4-Na??2HPO??4配制PBS-BSA缓冲溶液（pH＝7.4，含2.0%BSA及0.5%水解明胶，0.1%的 Proclin）。E3标准溶液的配制：称取E3标准品0.0042 g，加420 　　SymbolmA@ L无水乙醇溶解得10 g/L的E3溶液，取该E3溶液100 mL，加4.9 mL无水乙醇、5 mL蒸馏水，配成0.1 g/L的E3标准溶液。取此E3标准液，用PBS-BSA缓冲液梯度稀释，配制100, 30, 10, 3和1 SymbolmA@ g/L的E3标准溶液，??4 ℃保存??。E3-HRP溶液的配制：取E3-HRP溶液，以PBS-BSA缓冲液为梯度稀释，配制1∶100, 1∶200??, 1∶500, 1∶800和1∶1000（V／V）的E3-HRP溶液， 　　4 ℃保存。FITC-E3抗体溶液的配制：取FITC-E3抗体，以PBS-BSA缓冲液梯度稀释，配