胡黄连苷Ⅱ在大鼠脑缺血损伤中抗氧化作用及其最佳治疗剂量和时间窗.docVIP

胡黄连苷Ⅱ在大鼠脑缺血损伤中抗氧化作用及其最佳治疗剂量和时间窗 　　摘要：目的 通过正交试验优化胡黄连苷Ⅱ治疗大鼠脑缺血损伤的最佳剂量和时间窗。方法 应用双侧颈总动脉结扎法建立大鼠前脑缺血模型，按照正交试验设计分组，经腹腔注射胡黄连苷Ⅱ干预治疗。应用硫代巴比妥酸法、硝酸还原酶法和光化学法，分别测定血清和脑组织中脂质过氧化物丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和过氧化氢（H2O2）的含量。结果 胡黄连苷Ⅱ治疗脑缺血损伤的最佳效果，根据血清MDA、NO和H2O2含量分析，分别为脑缺血1.5 h腹腔注射10、20、10 mg/kg体质量。根据脑组织MDA、NO和H2O2含量分析，分别为脑缺血1.5 h腹腔注射10、20、20 mg/kg体质量。结论 从用药剂量最小化和治疗时间窗最大化的角度综合评价，胡黄连苷Ⅱ治疗脑缺血损伤的治疗时间窗和剂量最佳组合为脑缺血1.5 h腹腔注射10～20 mg/kg体质量。 　　关键词：胡黄连苷Ⅱ；脑缺血；剂量；时间窗；丙二醛；一氧化氮；过氧化氢；大鼠 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.11.015 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）11-0040-04 　　脑缺血后体内氧自由基产生和清除失衡，使机体处于氧化应激状态[1]。氧自由基攻击生物膜中的多聚不饱和脂肪酸引起脂质过氧化反应，导致细胞内环境紊乱[2]。脂质过氧化物丙二醛（MDA）的醛基与神经细胞生物膜磷脂中的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的氨基组分发生交联，导致细胞凋亡[3]，其含量可反映组织的脂质过氧化程度[4]。一氧化氮（NO）能与O2-生成毒性更强的OH-和NO2-，加重缺血损伤[5-6]。细胞培养研究表明，胡黄连苷Ⅱ可减轻过氧化氢（H2O2）诱导的PC12细胞损伤，提高细胞存 　　基金项目：国家自然科学基金；山东省自然科学基金（ZR2011HM050） 　　通讯作者：张美增，Tel：0532 　　活率[7]。动物实验表明，胡黄连苷Ⅱ能抑制大鼠脑缺血后缺血半影区相关炎性因子表达和细胞凋亡，改善大鼠的神经行为功能[8]。本课题组前期研究显示，胡黄连苷Ⅱ治疗脑缺血损伤的治疗时间窗和剂量最佳组合为脑缺血1.5 h腹腔注射20 mg/kg[9]。本实验通过检测脑缺血大鼠血液和脑组织中氧自由基水平变化，旨在进一步探讨胡黄连苷Ⅱ在脑缺血损伤中的抗氧化作用及最佳治疗剂量和时间窗。 　　1 材料与方法 　　1.1 造模 　　成年健康雄性SPF级Wistar大鼠30只，体质量230～250 g，青岛市药品检验所实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（鲁）动物置实验室适应环境1周，自由进食、饮水；室温（23±2）℃，自然光照。随机抽取5只作为假手术组，其余25只分离并结扎双侧颈总动脉建立前脑缺血模型[10]。术前动物禁食12 h，经10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/kg），仰卧固定、无菌操作。假手术组不结扎颈总动脉，其余操作同实验组。术后2 h仍未苏醒或死亡的4只动物剔除，将造模成功的动物21只再随机分为模型组5只和治疗组16只。 　　1.2 设计分组 　　治疗组按照二因素四水平L16（45）正交试验设计原理分组（见表1）。治疗时间窗为A因素，设缺血1.0、1.5、2.0、2.5 h共4个水平；治疗剂量为B因素，设5、10、20、40 mg/kg体质量4个水平。 　　1.3 干预措施 　　胡黄连苷Ⅱ（批号39012-20-9，纯度98%，分子量512.48，天津奎青医药公司提供），应用生理盐水溶解稀释成1%溶液，按表1设计，在相应的缺血时间腹腔注射相应剂量的胡黄连苷Ⅱ。假手术组和模型组术后2 h同步腹腔注射等量生理盐水。 　　1.4 标本采集 　　大鼠给药24 h后，以10%水合氯醛0.3 mL/kg腹腔注射麻醉，开胸经心脏取血4 mL，4000 r/min离心10 min，分离血清， -20 ℃保存。经心脏灌注生理盐水200 mL，快速开颅，完整取脑，切除嗅球和额叶前部脑组织，自视交叉（Bregma 0 mm）向后切取缺血部位脑组织500 mg，置预冷研钵中研磨至粉末状后按1∶4比例加细胞裂解液（碧云天生物技术研究所），超声波匀浆，4 ℃冷冻离心机（Eppendorf 5801型，德国）12 000 r/min离心10 min，去沉淀组织留上清液，-20 ℃保存备用。 　　1.5 评价指标 　　应用硫代巴比妥酸法、硝酸还原酶法和光化学法，分别测定血清及脑组织匀浆中脂质过氧化物MDA、NO和H2O2水平。按试剂盒（南京建成生物科技公司）说明书操作，取血清及脑组织匀浆室温复溶，