ω-3多不饱和脂肪酸对结肠癌细胞的作用及机制研究-基础医学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 本论文属于 保密 ，在 年解密后适用本授权书。 不保密 。 （请在相对应的方框内打“√” ） 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名 ： 日期： 年 月 日 天津 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的 已有报道ω-3 多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids, PUFAs）能够抑制 肿瘤的发生和肿瘤细胞的增殖，但作用机制尚未完全清楚。YAP 作为 Hippo 通 路中的核心蛋白，在肿瘤的发生及增殖中起重要作用。本研究拟观察ω-3 PUFAs DHA 和 EPA 对结肠癌细胞的作用；探讨相应的作用机理；揭示ω-3 PUFAs DHA 和 EPA 作用于结肠癌细胞的信号通路，为预防结肠癌的发生和辅助治疗提供理 论依据和候选药物。 方法 1.通过 MTT 法观察 DHA 和 EPA 对结肠癌细胞 HT-29 和 LOVO 增殖的影 响；流式细胞术观察 DHA 和 EPA 对 HT-29 和 LOVO 细胞凋亡的影响。 DHA 和 EPA 处理 HT-29 和 LOVO 细胞，通过 Western Blot 检测上述细 胞中 YAP 及其磷酸化 YAP（p-YAP）的水平；并对比不同浓度梯度 DHA 和 EPA 的作用结果，确定最适作用浓度。 DHA 和 EPA 处理 HT-29 和 LOVO 细胞，激光共聚焦显微技术（ Confocal laser scanning microscopy ,CLSM）观察细胞中 YAP 的核浆定位。 4.采用 RNA 干扰技术沉默 YAP 的表达, DHA 和 EPA 处理干扰 YAP 后的 HT-29 和 LOVO 细胞，通过实时荧光定量 PCR 检测上述细胞中 YAP 靶基因 mRNA 的变化。 5. DHA 和 EPA 处理 HT-29 和 LOVO 细胞后，通过 Western Blot 检测上述 细胞中 LATS 及其磷酸化 LATS(p-LATS)的变化。 6.分别干扰 Hippo 通路中 LATS 及 MST，DHA 和 EPA 处理干扰后 HT-29 和 LOVO 细胞，通过 Western Blot 检测上述细胞中 YAP 及 p-YAP 的变化。 7.通过免疫组织化学技术（Immunohistochemistry,IHC）检测人结肠癌组织 与正常肠组织中 G 蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors, GPCRs）GPCR40 和 GPCR120 是否存在。 8.分别干扰 GPCR40 和 GPCR120, DHA 和 EPA 处理干扰后 HT-29 和 LOVO 细胞，通过 Western Blot 检测上述细胞中 LATS 及 p-LATS。 9.在 HT-29 和 LOVO 细胞中过表达突变型的 Gs 蛋白后，DHA 和 EPA 处 理上述细胞，通过 Western Blot 检测上述细胞中 p-YAP 和 p-LATS。 I 10.用 PKA 的抑制剂 H89 处理 HT-29 和 LOVO 细胞，DHA 和 EPA 处理上 述细胞，通过 Western Blot 检测上述细胞 p-YAP 和 p-LATS。 结果 1. MTT 实验结果表明 DHA 和 EPA 对结肠癌细胞的增殖有抑制作用，并 且有时间和浓度依赖性。 2.流式细胞术结果表明 DHA 和 EPA 促进结肠癌细胞的凋亡。 3.Western Blot 结果表明 DHA 和 EPA 促进结肠癌细胞 p-YAP 增加，且有 时间和浓度依赖性。 .激光共聚焦试验结果显示：DHA 和 EPA 能促进 YAP 的核浆转移。 .实时荧光定量 PCR 结果显示：DHA 和 EPA 处理结肠癌细胞后，YAP 的 靶基因（促增殖基因及抗凋亡基因）在 mRNA 水平上明显下降；DHA 和 EPA 处理沉默 YAP 后的结肠癌细胞，YAP 的靶基因（促增殖基因及抗凋亡基因）在 mRNA 水平上不再变化，说明 DHA 和 EPA 降低这些基因