ω-3脂肪酸去饱和酶转基因羊的研究-临床兽医专业论文.docxVIP

山东农业大学硕士学位论文 山东农业大学硕士学位论文 ω- ω- 3 脂肪酸去饱和酶转基因羊的研究 PAGE PAGE 1 PAGE PAGE 2 中 文 摘 要 多不饱和脂肪酸(PUFAs) 是细胞膜的重要组成成分，在机体的激素代谢和多种酶活 性的调控中起着重要功能，一旦缺乏会引起机体生理失调而导致多种疾病，其中最具生 物学功能的是 ω- 3PUFAs 和 ω- 6 PUFAs。研究发现 ω-6 PUFAs 对人体意义不大，其过 量的摄入反而会危害人体健康。而 ω-3 PUFAs 对人体却有积极的意义，已被证实在预防 和治疗心血管疾病、关节炎、癌症等多种疾病方面发挥着重要作用。由于哺乳动物及人 类不能在体内合成 ω-3 PUFAs 与 ω-6PUFAs，因此必须从食物中摄取来满足需要。由于 自然界中 ω-6 PUFAs 含量丰富而 ω-3 PUFAs 含量极少，导致人体中 ω-6 PUFAs 摄入过 多而 ω-3 PUFAs 摄入严重不足，使人体中 ω－6/ω－3 之比高达 16 以上。而根据相关的 研究，ω-6 和 ω-3 PUFAs 的比例应该在 1 为适宜，所以人体通常处于 ω-3 PUFAs 供应不 足的状态。哺乳动物体内维持一定量的 ω-3 PUFAs 可以起到预防心血管疾病、神经退行 性疾病甚至癌症的作用，ω- 6 与 ω-3PUFA 的平衡对机体正常生长和内环境的稳定有重 要作用，如何增加人体 ω-3 PUFAs 的摄入量就成了合理利用脂肪酸的关键。 ω-3 脂肪酸去饱和酶基因是 ω-3 PUFAs 合成的关键基因，它利用 ω-6 PUFAs 为底物， 在脂肪酸碳链甲基端第三个碳催化生成一个不饱和键，从而合成相应的 ω-3 PUFAs。 Fat-1 基因广泛存在于真菌、植物和一些低等动物中，它可以通过产生出 ω-3 脂肪酸脱 氢酶将多不饱和脂肪酸从 ω-6 转化为 ω-3 形式而发挥功能。研究人员已经在转基因动物， 如：小鼠、猪等，表达了 Fat-1 基因，这些研究为探索 ω-3 PUFAs 功能提供了高效、准 确的医学、营养学动物模型。 本研究采用分子生物学等技术手段，研究线虫 ω-3 脂肪酸脱氢酶基因。根据 Genbank 中报道的线虫 Caenorhabditis Briggsae 的 ω-3 脂肪酸脱氢酶 sFat-1 基因序列，对其密码 子进行优化，同时在 sFat-1 基因的上游引入增强子 SP163 序列，命名为 SP163-sFat-1。 人工合成 SP163-sFat-1，然后进行克隆、测序，结果序列正确。采用分子生物学技术， 将 SP163-sFat-1 基因克隆在真核表达载体 pcDNA3.1 的 CMV 启动子的下游，构建了 sFat-1 基因的真核表达载体 pCDNA3.1(+)-sFat-SP163。 采用脂质体介导法，将 pCDNA3.1(+)-sFat-SP163 转染 CHO 细胞，同时用 pCDNA3.1(+)作为对照。分别用 G418 对转染的 CHO 细胞进行抗性筛选，获得了相应的 稳定混合细胞系，阳性率达 90%以上。将 pCDNA3.1(+)-sFat-SP163 转染的细胞系命名 为 sFat-1-CHO，将 pCDNA3.1(+)转染的细胞命名为 pCDNA3.1-CHO。分别采用荧光定 量 RT-PCR 方法和 Western-blot 方法，对 sFat-1-CHO 与 pCDNA3.1-CHO 进行检测，结 果目的基因进行了转录，比 pCDNA3.1-CHO 高 105 以上；同时目的基因进行了表达， sFat-1-CHO 成功表达了 sFat-1 蛋白，采用气相色谱法，对 sFat-1-CHO pCDNA3.1-CHO 进行脂肪酸分析，结果 sFat-1-CHO 中 ω-3 PUFAs 的含量比 pCDNA3.1-CHO 高，且 ω-6/ω-3 的比例下降，表明 sFat-1-CHO 表达的目的蛋白具有生物学活性。 该研究为进一步利用转基因技术促进动物自合成多不饱和脂肪酸的保健性食品提 供了试验数据。 关键词: ω-3 脂肪酸脱氢酶；ω- 3 多不饱和脂肪酸；基因合成；脂肪酸分析；转基因技 术 The Study On Transgenic Sheeps with ω-3Fatty Acid Desaturase Gene Abstract Polyunsaturated fatty acids(PUFAs) are important components of cell membrane，which plays important functions in body’s hormone metabolism and the regulati