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芦荟原生质体融合研究 　　摘要：以芦荟叶片为试材，采用酶解方法进行原生质体分离，并在此基础上对斑纹芦荟和不夜城芦荟进行原生质体融合。结果表明，以芦荟的叶肉细胞为试材，可成功分离出原生质体，而且活力较高，达90％以上。聚乙二醇(PEG)融合的结果可获得部分融合体。芦荟原生质体的成功分离主要取决于材料的来源、酶液的组成，另外还受酶解液的渗透压、温度和pH值等影响。融合的效率主要受融合剂的浓度、原生质体的生理状态及处理的时间等影响。 　　关键词：芦荟；原生质体；分离；融合 　　中图分类号：Q949.71?@8.23；Q943.1　文献标识号：A　文章编号：1001-4942(2010)10-0027-03 　　 　　　芦荟是百合科芦荟属的一种集观赏、药用、食用、美容和保健于一身的植物，具有极高的开发应用价值，素有“多备良药”、“天然美容师”和“家庭医生”等美称。它含有多种对人体有益的物质，现已形成了一股世界性的芦荟保健热，从而带动了我国芦荟栽培产业的发展。本试验以不夜城芦荟和斑纹芦荟的叶片为试材，采用酶解法分离原生质体，以聚乙二醇(PEG)诱导分离得到的原生质体进行融合，以期为芦荟离体培养快速繁殖和采用原生质体融合技术改良芦荟提供技术支持。 　　 　　1、材料与方法 　　 　　1.1　材料 　　不夜城芦荟(Aloe nobilis HaW.)和斑纹芦荟[Aloe vera L.var.chenensis(Haw.)Berger]的鲜嫩叶片 　　1.2　方法 　　1.2.1　酶解取芦荟的鲜嫩叶片，用自来水冲洗干净，并以70％乙醇消毒。在超净工作台上，叶片用0.1％升汞溶液浸泡灭菌10min(中间摇动几次)。取出叶片，无菌蒸馏水漂洗5次。将叶片放人大培养皿中，吸去水分，叶背面朝上，用无菌镊子小心撕去下表皮，或用解剖刀将叶片切成0.5mm的薄片。取叶片约2g置于10ml酶解液(表1)中，在25-28℃暗处酶解6-7h。另取一小片叶肉压片，显微镜下观察芦荟的完整细胞做对照。 　　1.2.2　纯化用200目筛网过滤酶解液，滤液经800r/min离心5min，弃去上清液。用3-4ml13％CPW液(表1)洗涤并溶解沉淀，悬液经1000r/min离心5min，留1ml上清液，其余弃之。取10ml离心管1支，注入20％蔗糖3ml，将1ml混有原生质体的上清液用滴管吸出并小心地铺于蔗糖溶液上，1000r/min离心5-8min，将位于中间一层的原生质体用吸管小心吸出至另一离心管中。用13％CPW液洗涤1-2次，每次1000r/min离心5min，得到较为纯净的原生质体。用13％CPW液悬浮至一定密度并制片，镜检。 　　1.2.3　活力鉴定取1滴原生质体提取液在载玻片上，加入相同体积的0.5％的藏红溶液，静置2min后，显微镜观察，并计算原生质体的活力。 　　原生质体的活力(％)=活的原生质体/总原生质体×100 　　1.2.4　原生质体的融合原生质体融合采用PEG和高Ca2+、高pH法。室温将两滴亲本原生质体悬液滴在置于直径5cm培养皿中的25mmx25mm盖玻片上。静置20min后从液滴边缘加入一滴溶液A(含分子量6000的PEG40％，葡萄糖0.3mol/L，CaCl266mol/L，二甲亚砜10％)。再静置20min后，制片，显微镜下观察原生质体融合的情况，并计算其融合率。 　　融合率(％)=融合的细胞数/细胞总数×100 　　 　　2、结果与分析 　　 　　2.1　原生质体体系的建立 　　使用纤维素酶、果胶酶成功降解了芦荟的细胞壁成分，然后经过滤、离心和漂浮3种方法相结合进一步纯化，得到了较为纯净的原生质体(图1)。 　　藏红染色后观察，呈红色的是没有活性的原生质体，无色的是有活性的原生质体，因为有活性的原生质体细胞膜具有选择通透性，藏红是拒染的，而没有活性的原生质体细胞膜失去了选择通透性，藏红染料就可以进入。本试验观察了120个原生质体，其中有活性的为112个，计算其活力为93.3％。 　　研究发现，芦荟的叶肉细胞是分离原生质体较好的材料，从叶片中可以分离出大量的比较均匀一致的原生质体。由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易到达细胞壁，而且叶肉原生质体有明显的叶绿体存在，可为培养后杂种细胞的选择提供天然的标记。在以叶片制备原生质体时植株的年龄和生长条件十分重要，最好选用植株上充分展开的幼嫩叶片。 　　植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。但是不同的材料会采用不同的酶组合，本试验采用1％纤维素酶和1％果胶酶配合使用效果较好。 　　在酶解液中渗透压的大小也会直接影响到分离原生质体的质量，因为失去了细胞壁