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葡萄中白藜芦醇合成酶基因克隆及其转化黄芪研究 　　摘要：利用RT-PCR技术从巨峰葡萄中克隆获得RS基因的全长cDNA序列，并利用农杆菌侵染法转化黄芪。试验结果表明：经Vector NTI 11.0软件分析克隆获得的RS基因全长序列长度为1 241 bp，并带14 bp长度的poly（A）尾巴，包含930 bp的开放读码框（ORF），编码1个含310个氨基酸残基的蛋白质。生物信息学分析结果表明：RS基因编码白藜芦醇合成酶，对RS基因全长序列进行蛋白质结构域分析，证明该基因具有查尔酮合成酶N端保守结构域，其长度为225个氨基酸。对黄芪进行遗传转化结果表明：获得了3棵黄芪转基因阳性植株，通过DNA、RNA以及蛋白质水平证明RS基因已经完全整合到黄芪基因组中并表达。 　　关键词：白藜芦醇合酶基因（RS）；白藜芦醇；生物信息学；基因克隆；Blast2go 　　中图分类号： S663.101文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）09-0038-03 　　白藜芦醇（resveratrol，3，4′，5-trihydroxystilbene，简称Res）是1940年首次从毛叶藜芦（Veratrum grandiflorum）的根部获得的[1]。多年来，随着植化技术的提高以及药理学试验研究的深入，人们发现Res广泛存在于种子植物中，如葡萄[2]、花生[3]、虎杖[4]等。它具有许多医疗保健作用，如抗氧化、抗肿瘤、抗血小板凝聚、抗细菌和真菌、免疫护肝、治疗心血管病以及植物雌激素作用等[5-6]，因此Res已成为科学家们高度重视的天然活性成分。白藜芦醇合酶（resveratrol synthase，简称RS）是Res生物合成途径中的关键酶之一，它以 4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A为底物催化合成Res[7]。RS基因已在多种植物和微生物中进行了转化和表达，并在植物的代谢及调控等方面发挥生物学作用。通过植物基因工程改良植物对病原菌的抗性已成为一种有效且切实可行的策略，Res的高效抗菌能力已得到一致认可，因此基于RS基因的转基因植物很具研究前景，其次Res的药理活性也已日益引起人们的关注。但天然的植物中存在的Res毕竟是微量的，对RS的分子生物学研究将使利用基因工程、转基因等生物技术生产大量Res成为可能，因此对Res和RS的深入研究将为提高植物的抗性和人类的健康水平提供有效途径。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1植物材料（1）葡萄：巨峰葡萄，购自于水果市场；黄芪：膜荚黄芪，购自于种子公司。 　　1.1.2菌种和试剂（1）大肠杆菌感受态DH5α，购自于天根试剂有限公司，由笔者所在实验室活化保存。（2）农杆菌菌种EHA105，购自于天根试剂有限公司，由笔者所在实验室活化备用。（3）植物克隆载体pMD18-T Vector，购自于天根试剂有限公司。（4）植物表达载体pBR121，购自于天根试剂有限公司；植物RNA快速提取试剂盒，购自于美国Bio-Rad公司；PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒，购自于大连宝生物公司；罗氏Ⅱ型高效地高辛DNA标记和检测试剂盒，购自于美国Roche公司；其他分子生物学和组织培养等相关试剂，购自于天根试剂公司和国药集团。 　　1.1.3培养基大肠杆菌的培养基为LB培养基，农杆菌的培养基为YEB固体培养基和YEB液体培养基，植物材料的培养基为MS培养基。 　　1.2试验方法 　　1.2.1葡萄总RNA的提取将从市场上买回的巨峰葡萄经过液氮处理，然后参考Bio-Rad公司植物RNA快速提取试剂盒说明书进行总RNA提取，电泳检测提取的RNA质量，并将其保存在-80 ℃冰箱中，为下一步反转录备用。 　　1.2.2RS基因的克隆（1）cDNA第一?l链合成：参考大连宝生物公司PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂的说明书进行cDNA第一条链的合成，反应体系在 42 ℃ 条件下合成1 h，待反应结束后再将反应体系转到65 ℃条件的恒温金属浴中处理5～10 min，使反应体系过程中的逆转录酶失活，最后放置-20 ℃冰箱保存备用。（2）RT-PCR反应体系：根据GenBank中已经注册的RS基因（基因编号为：NM_001281044.1，GI编号为：526118256）序列，利用在线ORF Finder软件和MEME软件寻找序列的开放阅读框，利用Vector NTI 11.0软件设计引物。其中引物上添加相对应的酶切位点，上游引物PF序列为：CTAC[ZZ（Z]CCGGG[ZZ）]TGGCTTCAGTCGAGGAATT，其中下划线为SmaⅠ的限制性酶切位点；下游