胞外hmgb1通过sdf-1cxcr-4轴对脐血cd34+细胞的影响-卫生毒理学专业论文.docxVIP

安徽医科大学硕士学位论文 1 英文缩略词表(abbreviations) 造血干细胞移植 Hematopoietic stem cell transplantation HSCT 移植物抗宿主病 Graft-versus-host disease GVHD 脐血移植 Cord blood transolantation CBT 移植物抗白血病 Graft-versus-leukemia GVL 基质细胞衍化因子 Stromal derived factor SDF-1 高迁移率族蛋白 B1 High mobility group box 1 HMGB1 低氧诱导因子 Hypoxia-inducible factor HIF 晚期糖基化终产物受体 Receptor for advanced glycation end products RAGE Toll 样受体 Toll-like receptors TLR 间充质干细胞 Mesenchymal stem cells MSC 粘着斑激酶 Focal adhesion kinase FAK 肿瘤坏死因子 Tumor Necrosis Factor TNF 磷脂酰肌醇-3-激酶 Phosphatidylinositol 3 – kinase PI3K 蛋白激酶 C Protein kinase C PKC cAMP 反应元件结合蛋白 cAMP response element binding protein CREB 二肽基肽酶 Dipeptidyl peptida DPPIV 急性髓细胞白血病Acute myeloid leukemiaAML人血清白蛋白Human serum albuminHSA肝细胞生长因子Hepatocyte Growth FactorHGF归巢Homing细胞膜脂筏 桩蛋白 Membrane lipid rafts paxillin PAGE 4 胞外 HMGB1 通过 SDF-1/CXCR-4 轴对脐血 CD34+细胞的 影响 摘 要 目的 探索 HMGB1（高迁移率族蛋白 B1）和/或 SDF-1（CXCL12,基质细胞衍化因子） 对脐血 CD34+细胞的迁移、阻断、粘附、克隆形成作用，并探讨 HMGB1 是否通过 SDF-1/CXCR-4 轴促进脐血 CD34+细胞的趋化作用。 方法 采集正常足月顺产新生儿脐血标本，羟乙基淀粉沉淀红细胞，通过淋巴细 胞分离液得到脐血单个核细胞，显微镜（5×）下计数单个核细胞数，使用 CD34+ 免疫磁珠分选得到 CD34+ 细胞，运用流式细胞仪检测 CD34+ 细胞的纯度。利用 Transwell 小室观察细胞的运动，其中上孔添加含 1*105/孔细胞液。利用不同浓度 HMGB1 和/或 SDF-1(0，10，25，50，100，200 ng/ml)检测 HMGB1 和/或 SDF-1 介 导脐血 CD34+细胞迁移作用的最佳浓度。脐血 CD34+细胞表达 CXCR-4(SDF-1 受体) 与 HMGB1 受体 RAGE。我们使用抗-SDF-1、抗 CXCR-4、抗-RAGE 抗体检测 HMGB1 单 独或与 SDF-1 联合对脐血 CD34+细胞迁移作用，进一步探讨哪种受体是 HMGB1 和/ 或 SDF-1 迁移作用所必须的。将新鲜分选的 CD34+细胞按照实验要求加至已经包被 的 96 孔板中，同时按照分组情况将细胞因子 SDF-1 及 HMGB1 加至相应孔，经孵育、 洗涤、再孵育、离心后，通过酶标仪检测各个组的吸光度值。将 0.9 %甲基纤维素 半固体培养基 CFC 加至 24 孔板中，每孔 3ml ，将 CD34+细胞液（细胞数为 1.0×105/ 孔）加入各组，每组 300ul，5%CO2 、37℃、饱和湿度的孵箱中培养 14d 后，电子 显微镜下（10×10）分别计数各组混合集落的生成，取平均值。 结果 1）磁珠分选的脐血单个核细胞中 CD34+细胞纯度为 95%以上，脐血 CD34+细 胞大量表达受体 CXCR-4，同时正常人外周血也表达 CXCR-4 受体。2）25ng/ml 的  SDF-1 不介导脐血 CD34+细胞的迁移运动，而其最佳趋化浓度为 100ng/ml ， 100ng/ml 系 HMGB1 单独作用的适宜浓度。通过剂量实验，我们发现 100ng/mlHMGB1 联合 50ng/mlSDF-1 可 以 更 好 的 发 挥 协 同 作 用 （ P0.05 ）。 3 ） 阻 断 实 验 中 抗 SDF-1(4ug/ml)和抗-CXCR-4（5ug/ml）抗体可减弱 HMGB1 独自或联合 SDF-1 介导 的趋化运动。同时抗-RAGE 抗