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苦马豆素对家兔睾丸生精细胞周期影响 　　摘要：为研究苦马豆素对家兔睾丸生精细胞周期的影响，进一步探讨疯草的中毒机理，将24只雄性家兔随机分为对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，试验组分别按照Ⅰ组15%（苦马豆素含量30 mg/kg）、Ⅱ组30%（苦马豆素含量60 mg/kg）、Ⅲ组45%（苦马豆素含量90 mg/kg）的比例添加疯草小花棘豆，对照组仅饲喂苜蓿干草，试验期70 d。分别于攻毒后第14、第35、第70天每次每组随机采集2只家兔的睾丸，通过流式细胞仪测定生精细胞凋亡率和细胞周期的变化。结果显示，从第35天开始，试验组家兔生精细胞凋亡率均极显著升高（P0.01），其中单倍体细胞和二倍体细胞凋亡率均极显著升高（P0.01），但四倍体细胞数量无显著变化。与对照组相比，中毒家兔睾丸生精细胞数量在G0/G1期升高，在S期降低，而且G1期与S期细胞数量呈显著负相关。说明苦马豆素可导致家兔睾丸组织生精细胞凋亡，且呈现出一定的时间-剂量效应。 　　关键词：苦马豆素；家兔；生精?胞；细胞凋亡；细胞周期；时间-剂量效应 　　中图分类号： S816.1文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）09-0138-03 　　疯草是豆科黄芪属和棘豆属有毒植物的总称，是西北地区草原畜牧业危害最严重的有毒植物[1]，具有根系发达、返青早、抗逆性强、繁殖系数高等特点，极易成为草原中的优势种[2]。新疆维吾尔自治区每年因采食疯草中毒的放牧家畜约100万只（头），其中超过50%的中毒家畜死亡[3]。苦马豆素（swainsonine，SW）是一种多羟基吲哚里西啶生物碱，国内外研究表明其是疯草的主要毒性成分[4]，中毒家畜主要表现为繁殖系统和神经系统损伤，其中睾丸、卵巢、脑组织等器官均出现细胞空泡变性、细胞核萎缩等病理变化[5]。王帅等研究发现，SW可导致中毒家兔睾丸萎缩、精子数量与活性降低，最终导致雄性动物生精功能障碍[6]。张?偶觳饬?SW对大鼠大脑皮质神经细胞的毒性作用，发现SW 可导致神经细胞核浓缩，DNA 片段化，最终导致细胞凋亡[7]。目前有关SW对细胞凋亡影响的试验主要集中于其对癌细胞和神经细胞的作用上，对生精细胞的凋亡及其机制未见报道。本试验通过制备亚慢性疯草中毒家兔模型，探讨苦马豆素对家兔生精细胞周期的影响，为家畜疯草中毒的防治提供基础。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料、试剂与仪器 　　1.1.1材料 　　疯草样品为采自新疆维吾尔自治区策勒县恰哈乡的小花棘豆（Oxytropis glabra DC）风干样，由塔里木大学动物科学学院草业科学教研室鉴定。 　　1.1.2试剂 　　Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒，美国BD 公司；DNA-Perp Stain 细胞周期试剂盒，美国Beckman Coulter公司；其余试剂均为国产分析纯。 　　1.1.3仪器 　　FAC Scam 型流式细胞仪，美国BD 公司；5810 R型高速冷冻离心机，德国Eppendorff公司。 　　1.2试验动物分组与处理 　　雄性家兔24只，体质量（2.0±0.1） kg/只，平均分为对照组和3个试验组，分笼饲养。对照组仅饲喂青苜蓿干草，试验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别饲喂掺入小花棘豆15%、30%、45%（按气相色谱法计算苦马豆素含量分别为30、60、90 mg/kg[8]）的混合干草，试验期70 d。试验第14、第35、第70天各组分别剖杀2只家兔取睾丸，将家兔睾丸组织剪成1～2 mm大小，置于5 mL PBS液（pH值7.4）中，涡旋振荡3 min后使用400目尼龙滤网过滤，1 500 r/min离心5 min后弃去上清，再置于 5 mL PBS液中混匀。相同条件下重复3次即得到单细胞悬液，用于细胞周期比例和细胞凋亡率的检测。 　　1.3苦马豆素对家兔生精细胞周期的影响 　　使用PBS冲洗单细胞悬液1～2 次，加入质量浓度为0125%的胰蛋白酶消化2 min，含血清培养液终止消化后弃去上清，PBS 漂洗3次后收集细胞于离心管中；4 ℃、2 000 r/min 离心10 min后弃去上清，加入1 mL 75%乙醇 4 ℃ 固定过夜；然后4 ℃、2 000 r/min条件下离心10 min后弃去上清，PBS 漂洗3次后再于4 ℃、2 000 r/min条件下离心10 min，将细胞重悬于200 μL PBS液中，加入 5 μL RnaseA，37 ℃反应1 h，再加入 10 μL Triton-X-100 和 5 μL PI，4 ℃下避光孵育 30 min，1 h 内使用流式细胞仪检测。 　　1.4苦马豆素致家兔生精细胞凋亡率的测定 　　使用PBS冲洗单细胞悬液1～2 次，加入质量浓度为0125%的胰蛋白酶消化2