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西瓜抗病毒RNAi植物表达载体构建 　　摘 要：为了研究转化同一种病毒的不同基因在转基因西瓜中引发RNA沉默的效果以及利用RNA沉默培育抗多种病毒的策略，以pFGC5941为骨架质粒，分别构建了ZYMV cp、nib和Hc-Pro基因的反向重复植物表达载体pFIRzYMVCP、pFIRZYMVNIb和pFIRZYMVHc-Pro；利用重叠延伸PCR的方法，首先构建了含有CMV cp、WMV cp和ZYMV cp部分基因片段的CWZ cp三价基因，采用该三价基因构建了cWZ cp基因的反向重复植物表达载体pFIRCWZCP。研究首次在国际上构建了西瓜转基因抗病毒RNAi植物表达载体，为探讨RNA沉默在转基因抗病毒西瓜中的应用奠定了基础。 　　关键词：西瓜；病毒病；RNA沉默；植物表达载体 　　中图分类号：S651　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2009)04-525-07 　　 　　小西葫芦黄化叶病毒(Zucchini yellow mosaicvirus，ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaicvirus，WMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和番木瓜斑驳病毒(Papaya ringspot virus，PRSV)等的大发生严重制约了西瓜产业的发展，尤以ZYMV、WMV和CMV发生最为普遍和严重，造成了重大的经济损失。生产上缺乏有效的防治措施，因此有效地控制西瓜病毒病的发生与危害是西瓜持续生产发展的保障，利用抗病品种是最为可行的途径，通过转基因创制抗病毒新种质可以克服传统育种所遇到的障碍。RNA沉默技术已被证实是植物抗病毒的一种新策略。 　　转录后基因沉默(post transcriptional gene si-1encing，PTGS)也称为RNA干扰或RNA沉默，是转录后mRNA产生的特异序列降解的机制。PTGS最初是Napoli等在矮牵牛上发现的，转基因和同源的内源基因在转化植株中的表达同时受到抑制。利用含有大麦黄矮病毒(Barleyf20W dwarf virlus，BY-DV)PAV株系的复制酶基因片段构建成可产生发夹式RNA结构的载体，并将该载体导入大麦得到强抗性植株且可稳定遗传。Kai等证实包含TMV部分eDNA序列的反向重复转基因烟草对TMV具有很好的抗性。最近，Kamachi等将黄瓜绿驳斑点病毒的外壳蛋白基因的ihpRNA载体导入烟草，诱导RNAi的产生，使烟草获得了对该病毒的抗病毒性，证实烟草抗黄瓜绿驳斑点病毒是通过RNA沉默引起的，并且这种抗性是很高效的，为进一步获得抗CGMMV的黄瓜或西瓜奠定基础。基于这些研究，我们在西瓜上研究RNAi介导的抗病毒效果，以期通过转基因培育抗病毒西瓜新种质。 　　 　　 　　 　　为了分析同种病毒的不同基因与RNAi介导的基因沉默是否有关，评价不同基因对于西瓜抗病毒病的效果，构建了ZYMV外壳蛋白基因cp(coat pro－tein)、ZYMV复制酶基因nib和ZYMV Uc-Pro蛋白酶基因(helper component-proteinase，HC-Pro)的反向重复表达载体，以期分析这些基因在转基因西瓜中引发的RNA沉默效果，为进一步培育抗病毒西瓜新种质提供理论依据。我们为培育抗多种病毒病的转基因西瓜新品系，重组了分别含有CMV、WMV和ZYMV cp保守区域的三价CMZ cp基因，构建了CMZ cp基因的反向重复表达载体pFIRCWZ CP，期望分析转3种病毒CMZ cp基因的西瓜植株对于3种病毒的抗病毒效果，为培育具有抗多种病毒的西瓜新品系奠定了基础。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1.1　实验材料 　　植物表达载体pFGC5941为骨架质粒，由CaMV 35S启动子驱动，章鱼碱合成酶基因的终止子(OCS 3′)，目标基因正反向片段插入位点之间由长约1.4 kb的矮牵牛查尔酮合酶A基因内含子(CHSA intron)隔开。pZYMV CP、pZYMV NIB和pZYMV Hc-Pro的质粒为本实验室所有：DH5a为本实验室保存的菌株；各种限制性内切酶购自MBI公司；TaqDNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自TAKARA公司；引物在英骏公司合成。 　　 　　1.2　构建ZYMVCP、nib和Hc-Pro基因片段的植物表达载体引物 　　采用本实验室保存的ZYMV外壳蛋白基因cp(登录号：AY611025)、复制酶基因nib(登录号：AY611023)和Hc-Pro基因(本实验克隆还未登陆)，分别构建含有基因片段ZYMV cp，ZYMV nib和ZYMV Hc-Pro 3个反向重复植物表达载体。根据基因序列和载体上酶切位点，分别添加合适的限制性内切