定量蛋白质组silac内标制备技术和高转移潜能肝癌细胞磷酸化蛋白质组学研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

安徽医科大学硕士学位论文 HYPERLINK \l _bookmark0 4. 附录 55 HYPERLINK \l _bookmark1 4.1 个人简历 55 HYPERLINK \l _bookmark2 4.2 获得的奖励： 55 HYPERLINK \l _bookmark3 4.3 在学期间已发表和拟发表的学术论文 55 HYPERLINK \l _bookmark4 5. 致谢 57 HYPERLINK \l _bookmark5 6. 综述及参考文献 59 iii 安徽医科大学硕士学位论文 安徽医科大学硕士学位论文 PAGE PAGE 10 英文缩写词对照表 缩略词 英文全称 中文注释 ACN Acetonitrile 乙腈 DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜 DNEM/HIGH GLUCOSE Dulbeccos Modified Eagle Medium/High Glucose DMEM 高糖培养基 DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇 FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清 FDR False Discovery Rate 错误发现率 HAc Ethanoic Acid 乙酸 HPLC High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱 IAA Iodoacetamide 碘乙酰胺 IMAC Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography 固定化金属亲合层析 i-TRAQ Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation 同位素标记相对和绝对 定量 LC-MS Liquid Chromatography-Mass Spectrometry 液相色谱-质谱联用仪 MeOH Methanol 甲醇 MOAC Metal Oxide Affinity Chromatography 金属氧化物亲和层析 S/N Signal to Noise Ratio 信噪比 SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基磺酸钠 SDS SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SILAC Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture 稳定同位素标记氨基酸 的细胞培养 TEMED N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine N,N,N,N-四甲基乙二胺 TFA Trifluoro Acetic Acid 三氟乙酸 定量蛋白质组 SILAC 内标制备技术和高转移 潜能肝癌细胞磷酸化蛋白质组学研究 摘要 蛋白质组学是系统鉴定和定量蛋白质，并研究蛋白质功能的新兴学科。随着 技术的进步和研究的深入，蛋白质组学在生命科学研究中得到了迅速的发展和推 广，并逐渐成为生命科学研究的有力支柱。在蛋白质组学定量研究中，基于稳定 同位素标记氨基酸的细胞培养（stable isotope labeling with amino acids in cell culture, SILAC）技术的定量蛋白质组学因灵敏度高、精度好，成为定量蛋白质组学的金标 准。但 SILAC 研究成功开展的前提是蛋白质组 SILAC 全标记定量内标的制备。国 际上通用的办法是经过 7 代以上的培养来获取，制备的周期长、费用高，标记效 率还受细胞类型、状态等的影响，制备的细胞还难于实现完全标记。本研究以肝 癌细胞系 MHCC 97-L 为对象，系统研究并开发了液氮冻存 SILAC 种子细胞的技 术体系，实现了快速、经济、高效、完全标记的 SILAC 内标制备。SILAC 标记并 且冻存的细胞经两天的复苏培养后便可重新获得和普通培养条件一致的高质量的 SILAC 标记的细胞，细胞的标记效率在 97%以上。SILAC 细胞与正常培养条件下 的细胞相比，其细胞形态、大小及倍增时间均没有明显变化。定量比较 SILAC 标 记的细胞在冻存前以及冻存复苏后的蛋白质表达谱，我们发现这两种状态的蛋白 质组无可见的差异。这为基于 SILAC 的定量蛋白质组学研究提供了支撑。 磷酸化修饰是细胞中最为丰富、调控作用最为重要的一种蛋白质翻译后修饰 形式，在细胞正常生命活动和疾病的发生、发展中扮演了重要作用。尽管磷酸化 蛋白质组学研究是蛋白质翻译后修饰研究中最为成熟，通量最高的技术，但其研 究的深度还受制于磷酸化肽段的富集，至今难于全景式的揭示细胞中蛋白质组的 磷酸化状态。我们系统调查了 IMAC（i