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赤霉素对菠菜性别分化影响及分子机制 　　摘要：以日本大叶菠菜为供试材料，采用温室内盆栽种植的方式，利用赤霉素（GA3）进行处理，探讨其对雌雄异株植物菠菜性别分化的影响。结果表明，试验组在第1次处理后植株就有明显的生长，表现为植株茎秆变长、较对照组粗壮、开花期提前。与对照组相比，试验组雌雄比例（1.33）明显大于对照组（0.96）。此外，发生性反转植株中，雌株转变为雄株与雄株转变为雌株的比例为1.14。利用Y染色体紧密连锁的雄性特异T11A分子标记对性反转植株进行检测，结果表明，雌株转变为雄株，雄性特异条带出现；雄株转变为雌株，雄性特异条带消失。本研究结果为进一步研究激素对菠菜性别分化影响的分子机制奠定了基础。 　　关键词：菠菜；赤霉素（GA3）；T11A分子标记；性反转；性别分化 　　中图分类号： S636.101文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）05-0133-02 　　菠菜（Spinacia oleracea L.）为藜科菠菜属一年生或二年生草本植物，染色体组成为（2n=2x=12），具有生长周期短、表型丰富、营养价值高等特点，是一种大面积种植的蔬菜作物。菠菜系雌雄异株植物，其性别分化不但受到性别决定基因控制，还受到激素的影响[1]。在早期研究中，Chailakhyan等认为在长日照类型的菠菜中，赤霉素对性别表现的影响为促进雄性化[2]；El-Gizawy等的研究也表明赤霉素处理菠菜具有促雄作用[3-4]；而曹宗巽等则报道赤霉素在菠菜中有促雌作用[1]。由此可见，不同研究学者利用赤霉素处理菠菜，其诱导结果是有差异的。赤霉素对其他植物性别分化的影响也不尽相同，赤霉素可以促使某些植物雄性化，但是也可以导致某些植物雌性化，赤霉素对黄瓜雌性系性别分化的影响表现为能促进雄花分化，阻碍雌花分化[5]。在赤霉素对小桐子处理的试验中，结果表明外施赤霉素诱导小桐子雌花中原来停止发育的雄蕊重新正常发育，进而将其变成两性花[6]。在玉米不同的发育阶段，对叶面喷施赤霉素，能够使玉米雄花穗变成雌性、雄性不育或保持雄性可育[7]。赤霉素还可以诱导宽叶慈菇雄株及三性花同株向雌株性别的转换[8]。 　　尽管前期有不少学者研究了赤霉素对菠菜性别分化的影响??并得出了不同的结论，但是其研究结果只关注于赤霉素对菠菜外观形态特征的影响，至于赤霉素为什么会导致菠菜的性别转化缺乏深入的研究。本研究以日本大叶菠菜为供试材料，采用外源赤霉素处理受试菠菜植株，观察处理前后菠菜性别变化的情况，并利用菠菜Y染色体紧密连锁雄性特异标记T11A对性反转植株进行基因组检测，从分子水平探讨其对雌雄异株植物菠菜性别分化的影响，本研究结果为进一步揭示赤霉素对菠菜性别分化影响的分子机制奠定了基础。 　　1材料和方法 　　1.1试验材料 　　供试材料为日本大叶菠菜。2013―2014年连续在河南师范大学植物组织培养室种植菠菜。种植前先将种子进行人工春化（4 ℃，7 d左右），然后播种于含有培养土和蛭石（培养土、蛭石体积比为1 ∶[KG-*3]1.5）的土壤中（混合后放入植物组织培养室常用的小型花盆中），并给予充足的水分。培养条件为光照14～16 h、黑暗8～10 h的长日照，均采用日光灯管照明，经照度计检测光照度为3 000 lx，培养温度（20±2）℃，直至全部正常开花。 　　1.2试验方法 　　1.2.1赤霉素处理 　　将种植的菠菜随机分为2组，试验组和对照组，每组均为100株。对试验组进行处理，根据前期学者研究结果[1]，将赤霉素处理浓度定为50 mg/L，对每株菠菜植株均匀喷洒赤霉素，对照组则喷水。每隔3 d用同一浓度赤霉素处理1次，处理后观察植株的变化，随后均正常浇水。试验组由于每棵植株开花时间略有差异，因此每隔2 d统计1次，统计时严格按照菠菜雌雄植株开花特点，准确区分绝对雌株、绝对雄株及两性株，直至试验组和对照组菠菜植株均全部正常开花。 　　1.2.2性反转植株的分子检测 　　为了检测性反转产生的分子机制，进行如下处理：在赤霉素处理之前，剪取培养约2周的菠菜叶片，用改良的2×CTAB法提取每株菠菜的DNA[9-10]，用菠菜Y染色体紧密连锁的雄性特异标记T11A分子标记[11]鉴定菠菜的原始性别，引物序列为T11A-F，5′-CCCTAATTAACTCCTCTTTACCCAA-3′；T11A-R，5′-TACAAGCCCCATTATCATAACAGTC-3′。T11A反应体系（20 μL）为0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，14.4 μL H2O，2 μL buffer，1.5 μL dNTP，0.1 μL Taq DNA聚合酶；其扩增程序为94 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃