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适合贵州本土油菜遗传转化方法 　　摘要：为探索适合贵州本土油菜资源的遗传转化方法，以甘蓝型油莱品种黔油29号的父本6-18C和威宁抗冻芥菜型油菜的下胚轴为外植体，对种子消毒时间、愈伤形成的最佳激素组合以及生根阶段湿度和激素的影响进行了研究。结果表明：黔油29号父本材料84消毒时间10-20min皆宜，而芥菜型油菜的最佳消毒时间为10min；1.0 mg/L 2，4-D+0.3 mg/L Kinetin有利于农杆菌侵染后愈伤的形成；生根阶段控制培养基的水分对伸根的时间和效率至关重要，而NAA的影响程度较小。试验中发现在1.0 mg/L 2，4-D+0.3 mg/L Kinetin诱导条件下，油菜每个外植体上的出芽率为230%，而芥菜可高达560%。本文的研究成果可以为贵州甘蓝型油菜品种和地方芥菜型油菜的遗传改良提供技术支撑。 　　关键词：遗传改良；油菜；遗传转化 　　十字花科芸薹属具有最多的农作物和园艺植物，其中油菜为世界四大油料作物之一。油菜中三个重要的复合型栽培种包括白菜型油菜、甘蓝型油菜和芥菜型油菜。其中，甘蓝型油菜由于硫苷和芥酸含量较低、产量较高等特点，在全球的种植面积最为广泛，芥菜型具有耐干旱、耐贫瘠，抗性强等优势，主要分布在非洲、俄罗斯、印度和中国西南部山区，而白菜型的种植最少。贵州常年油菜种植面积在45h?O，其中芥菜型油菜占据30%。 　　随着转基因技术的兴起，并自1986年第一例转基因油菜诞生后，油菜转基因技术已广泛应用于种子品质改良（Hannoufa et al. 2014）、创制不育材料（Kumar et al. 2012）、培育抗除草剂（Li et al. 2014）、抗病虫害（Liu et al. 2014）和抗逆境胁迫的新品种（Sun et al. 2014）等方面。目前油菜转化的方法有农杆菌侵染法、子房注射法、基因枪法，选用的外植体包括下胚轴、子叶、花柄、花序。其中以农杆菌转化下胚轴最为常用。 　　然而油菜转化具有很强的基因型依赖性，目前，推广应用的转基因油菜体系大多是从加拿大春油菜栽培品种Westar等少数几个基因型上发展起来的，对于地方品种的转基因方法的探索也是油菜基因转化研究的一个重要方面，如已有的研究已针对西南大学甘蓝型黑籽品种D2、甘蓝型黄籽油菜品种“渝黄一号”的一个亲本GH01、云南芥菜型油菜生产品种88-122、88-242等建立了遗传转化体系。因此，笔者等以贵州甘蓝型油菜品种黔油29号的父本6-18C和地方芥菜型资源威宁芥菜，研究了种子消毒时间、激素对转化后愈伤诱导、以及生根阶段湿度等因素对遗传转化的影响，建立了高效再生转化体系，为通过生物技术手段创制适宜贵州生长和生产的油菜新种质奠定了技术基础。 　　一、材料与方法 　　1. 材料 　　贵州地区推广的半冬性甘蓝型油菜品种黔油29号的父本6-18C和贵州地方芥菜型油菜威宁芥菜，分别由贵州省油料研究所选育和收集。 　　2.菌株与质粒 　　根癌农杆菌菌株为GV3101。植物表达载体为pMDC83，带有增强型的2强型的载启动子，以及其驱动的mgfp6和Hygromycin抗性基因。 　　3.油菜遗传转化方法 　　（1）种子消毒时间。转化用油菜和芥菜的种子先用75%乙醇浸泡1min，然后加入50% 市售84（主要成份为次氯酸钠）消毒特定时间。油菜种子用50%84消毒10 min、15 min和20min，芥菜由于种子小种皮薄，50%84消毒时间较短，设置5 min、10min和15 min。消毒后的种子用无菌水清洗4-5次，然后播于1/2MS培养基。油菜每皿12粒，芥菜每皿25粒。将培养皿放置于无菌培养盒内，25℃黑暗培养6天。 　　（2）菌液准备。播种当天，在卡那抗性的LB平板上划线接种2板35S：GR-D农杆菌菌种，28℃＼培养4天。转化前一天，挑取单菌落于20 mlLB培养基内，28℃摇床以180-220 rpm转速培养12 h～16 h左右，使菌液OD值达到0.8左右。 　　（3）外植体准备。挑选健壮的下胚轴切为0.8-1.0 cm的小段。切好的下胚轴先放入装有20 ml的悬浮液体培养基的培养皿中，等下胚轴全部准备完毕，加入1ml 35S： GR-D农杆菌菌液，侵染30 min，每隔5 min，震荡摇匀一次。 　　（4）预培养和愈伤诱导。下胚轴侵染完毕后，尽量吸干残留的菌液，将其转移到培养基上诱导愈伤。培养基的基本组成为：4.74g/L MS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，100 ?M AS。并加入三种不同的激素组合，分别为：1.0mg/L6-BA+1.0mg/L IAA、1.0 mg/L 2，4-D+0.3 mg/L Kinetin和1.0mg/LTDZ（噻苯隆）+1.0mg/L IAA。暗光