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适合金银花不同组织总RNA提取方法筛选 　　摘要：对Trizol法、CTAB法、十二烷基磺酸钠（SDS）法、多糖多酚试剂盒法、改良多糖多酚试剂盒法5种RNA提取方法提取金银花叶片、茎、根、花蕾组织RNA的效果进行比较，以期获得质量较好的金银花不同器官的RNA，为后续分子生物学试验奠定基础。结果表明：改进后的多糖多酚试剂盒法能够克服金银花中RNA提取难度大的问题，能够提取到质量、产量都很高的RNA，且稳定性好、无DNA污染，可以满足进一步的半定量反转录PCR（RT-PCR）等试验需要。 　　关键词：金银花；不同组织；总RNA；提取方法；改良多糖多酚试剂盒 　　中图分类号： S184文献标志码： 　　文章编号：1002-1302（2016）08-0063-03 　　金银花（Floe Lonicerae）别称忍冬花、银花等，为忍冬科（Capfifoliaceae）忍冬属（Lonicera）植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）以及同属多种植物的干燥花蕾及其初开的花，具有清热解毒、凉???风热等功效[1]。当前，随着人们消费水平的提高及对中药材日益增长的需求，提高金银花的绿原酸产量、品质已经具有重大意义。有研究表明，在金银花绿原酸研究中，对控制绿原酸等活性物质相关酶基因在金银花不同部位的表达模式进行分析极其重要；同时，反转录PCR（RT-PCR）、cDNA文库构建等都需要高质量的RNA。目前，金银花总RNA提取方法包括Trizol法、SDS法等[2-4]。本研究以金银花根、茎、叶、花蕾为材料，通过对Trizol法、CTAB法、SDS、多糖多酚试剂盒法、改良多酚试剂盒法行比较，探索从富含多糖的金银花组织中提取高质量、无DNA污染的RNA方法，以期为金银花分子生物学研究及提高其活性成分含量研究奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料与试剂 　　供试材料为金银花的叶片、根、茎、花蕾。均取自湖南省隆回县金银花产业化种植基地（均由湖南中医药大学药学院周日宝教授鉴定为正品）。 　　RNA提取过程中使用的枪头、枪头盒、离心管等塑料器皿均用0.1% DEPC水浸泡4 h后高压蒸汽灭菌、烘干，研钵用75%乙醇润洗消毒。试验中所用提取液以及各种液态试剂均用0.1% DEPC水配制，于37 ℃放置过夜以抑制RNase活性。研钵、药匙及玻璃器皿用铝箔纸包好后于180 ℃烘箱中干热灭菌6～8 h。 　　各种试剂配制参照《分子克隆实验指南》进行。各种方法提取总RNA均定容为20 μL，重复试验3次。 　　1.2RNA提取方法 　　每种材料均比较了CTAB法[5-6]、SDS法[7-8]、Trizol法[9]、多酚多糖试剂盒法、改良多酚多糖试剂盒法提取RNA的效果。 　　1.2.1改良CTAB法称取0.2 g样品，参照孟丽等CTAB法[10]并略加改进进行提取（改进措施：①尽量采收幼嫩的植物组织作为提取DNA的材料；②将采集的样品及时放入液氮中；③在DNA缓冲液中加入β-巯基乙醇的用量达2.5%～3.0%；④在提取获得的DNA样品中加入RNase）。 　　1.2.2Trizol法称取0.2 g样品，参照陈静等的Trizol法[9]进行提取。 　　1.2.3SDS法称取0.2 g样品，参照王暑辉等SDS法[4]进行提取。 　　1.2.4多糖多酚试剂盒法称取0.2 g样品，按照Biospin多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（杭州博日科技有限公司）说明书进行规范化操作。 　　1.2.5改良的多糖多酚试剂盒法称取0.2 g样品，按照浙江BioFlus多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书，在步骤3后添加等体积酚-三氯甲烷抽提这一步骤；同时，每步操作均在冰盒内进行；在最后的DEPC处理水定容阶段，将原来的50 μL改为20 μL；其他过程同试剂盒说明书[11-12]。 　　1.2.6RNA完整性检测分别取1 μL各器官的总RNA，在1.0%质量浓度的凝胶上分析RNA的完整性、质量。由于通常情况下，总RNA研究中的利用特?c与要求，主要依据28S、18S rRNA凝胶电泳时所形成的谱带特征。如果带型清晰且亮度高，则表明所提取到的RNA样品量大且质量高，而且以28S rRNA谱带亮度高于18S rRNA更佳。同时，根据电泳结果还可以判断RNA样品中有无DNA、蛋白污染。 　　1.2.7总RNA纯度、浓度测定分别取1 μL根、茎、叶、花蕾的总RNA，稀释50倍后用核酸测定仪（Eppendorf，Biophotometer plus 6132），分别测量230、260、280 nm处的吸光度并计算D260 nm/D280 nm值、D260 nm/D230 nm值和RNA得率。 　　1.2.8半定量RT-PCR方法根据试