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重组工程研究进展 摘要　重组工程是近几年来兴起的一种基于体内同源重组的、新型的遗传工程。技术重组系统不需要限制性内切酶和DNA连接酶就可以进行DNA克隆和亚克隆。该技术操作简单，效率较高，可望为功能基因组学研究提供一个有力的工具。就重组工程的分类以及近几年来在基因组研究中的应用和进展做一综述。关键词 　　重组工程；同源重组；研究进展中图分类号Q81 　　 　　文献标识码A 　　文章编号1004-8421(2009)11-164-03 　　传统的以限制性内切酶和连接酶为基础的DNA重组技术曾经革命性地推动了分子生物学和遗传工程的发展，至今仍然发挥着重要作用。但限制性内切酶的应用有其局限性：①限制性内切酶的酶切位点“限制”了对DNA分子进行随心所欲的切割和连接；②仅能对小于20 kb的DNA片段进行操作，大分子DNA体外操作时容易断裂。另外，PCR扩增长片段DNA时易产生突变，且扩增数十kb的DNA分子也几乎是不可能的，上述问题时常困扰研究人员并导致研究工作的停滞不前。为了尽快利用这些全人类共有的宝贵资源，加速功能基因组学研究速度，迫切需要建立一种能够广泛应用的、进行大通量和快速基因操作的新技术。重组工程技术随着对微生物体内重组机制的研究即应运而生。 　　重组工程的优势在于能够以精确、高效率、简单、快速的方式完成传统DNA重组技术无法做到的复杂基因操作。由于该技术具有高效率、简单性和应用的广泛 　　性等独特优点，将来完全有可能取代传统的遗传工程技术。 　　 　　2　同源重组工程 　　 　　重组工程可定义为基于噬菌体短同源序列重组功能的遗传工程，或基于同源重组的遗传工程。 　　重组工程技术相对于传统DNA操作技术的优势表现在几个方面：①操作简便，比体外步骤相对简单；②不受DNA片段长短影响，可操作大到几百kb，小到一个kb的DNA片段；③它不受DNA序列的影响，没有限制性酶切位点都可操纵DNA片段。重组工程技术可精确地在染色体或质粒的任意位置进行操作，为后基因组研究提供了一个有力的武器。 　　2.1　传统的大肠杆菌体内同源重组 　　2.1.1　RecA重组。在细菌体内存在着内源性重组体系一RecA重组系统，它包含RecA、RecBCD等在内的一系列酶。RecA蛋白质是同源重组中最重要的蛋白组分之一，它能催化同源联会和链交换反应，而recB、recC、recD基因编码产物构成一个在同源重组中的功能单位RecBCD蛋白复合体。在大肠埃希菌中，RecBCD复合物首先与双链DNA末端结合，同时解旋并在特定位置切割DNA转变为2条单链DNA。RecBCD复合物持续解旋延伸3’一OH单链尾巴，产生一条约数千碱基的3’-OH单链DNA尾巴，RecA和SSB蛋白则促进这一单链侵入到另一个双链DNA分子(由DNA促旋酶协助形成超螺旋)中，被置换的另一条DNA链在RecA和SSB蛋白因子的帮助下与第l条链的单链缺口互补配对。链交联形成的hDNA可以通过RecBCD复合物的解旋作用以及Re-cA和SSB蛋白的链传递作用不断延伸，在此期间Holliday中间体被切开(可能由RecBCD催化完成)，并交换DNA末端形成2对重组分子，之后由DNA聚合酶补平缺口，DNA连接酶修复相应的磷酸二酯键。 　　2.1.2　Chi位点刺激的重组。Chi位点刺激的重组为在野生型细胞中用线性的双链DNA修饰基因组提供了一条途径，当Chi位点(5’CCTCCTCC3’)整合到线性双链DNA的2个末端时，可保护DNA不被RecBCD消化，并在野生型细胞中为RecBCD介导的重组提供DNA上的活性位点，还可跨越数千碱基的异源序列起作用。Dabert的研究表明，Chi位点刺激的重组可使基因置换的效率提高约50倍，可作为在野生型大肠杆菌或其他生物进行基因打靶的有效方法。 　　Chi位点刺激的同源重组的主要缺陷是效率很低，即使有长的同源区域仍然需要用正负筛选来寻找稀少的重组子。 　　2.2　噬菌体编码的重组系统噬菌体编码的重组系统是由噬菌体重组酶基因介导的体内同源重组过程，可有效促进线性DNA分子和染色体问的重组，直接在体内对染色体DNA或载体进行基因敲除、敲入、替换、引入单碱基突变或基因克隆，操作简单、精确、快速，可完成传统DNA重组技术无法做到的复杂基因操作。 　　重组工程系统包括基于缺陷型λ噬菌体的Red重组系统和原噬菌体Rac的RecE／RecT重组系统。 　　2.2.1　λ噬菌体的Red重组系统。Yu和Court博士最先将缺陷型λ噬菌体左向操纵子从att位点整合到大肠杆菌W31 10染色体上，建立了基于Red重组酶的高效修饰染色体DNA和BAC载体的新型同源重组系统。 　　Red系统介导的同源重组过程(图1)。λ噬菌体Red重组体系所包含