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重组猪α干扰素聚乙二醇修饰研究 　　摘要：采用分子量为20 kD单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯（mPEG-SC）修饰重组猪α干扰素，初步研究了修饰反应条件及分离纯化工艺。结果表明，单修饰PEG-IFNα的转化率达到65%，单修饰产品纯度达到97%。由于修饰产物相对分子质量和不均一性的增加，导致其体外杭病毒活性降低，抗病毒活性保留达到未修饰重组猪α干扰素的29%，仍然具有良好的抗病毒作用。 　　关键词：聚乙二醇；重组猪α干扰素；修饰 　　中图分类号：S828 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2015）06-0005-02 　　PEG（聚乙二醇）是一种中性、水溶性、无毒性的聚合物。在水溶液中长链的PEG分子，具有高水合性，可以附着到其他分子和表面上，提供了一个生物相溶的、保护性外壳。这种保护性外壳降低了生物系统对这些材料的清除能力，极大的降低了蛋白质、细胞和细菌的吸附，降低了肾脏的清除率。PEG在水和许多有机溶剂中可溶，在水溶液中它和其他聚合物如葡聚糖一起可形成双相系统。双功能PEG的水溶性、无毒性、高柔性和特征明确的化学特性，使它成为理想的修饰蛋白类产品的交联材料[1]。PEG与干扰素的偶联已广泛应用于用于临床。如先灵葆雅公司开发的聚乙二醇化人干扰素α-2β（商品名，佩乐能，PegIntron）；罗氏公司开发的聚乙二醇化人干扰素α-2β（商品名，派罗先，PegasyS）等。已经证实被偶联后的干扰素，生物学活性大部分得以保留，同时免疫应答极大地降低，血清半衰期也极大地得到了延长。 　　动物α型干扰素对畜禽病毒性疾病具有较好的防治效果。安徽医科大学微生物学教研室采用基因工程技术克隆并表达了猪α型干扰素，并将实验室合格产品制成冻干粉针剂发送至安徽省多家养猪场进行临床试验。结果证明，该室研制的重组猪α干扰素能有效治疗猪病毒性疾病。对治疗猪病毒性腹泻有效率为83.5%，治愈率为63.9%。在该项目的基础上，对重组猪α干扰素进行聚乙二醇化修饰，以获得长效制剂，从而延长药物在体内循环半衰期、减少体内清除率，减少给药次数、降低动物的应激性、增强疗效、降低用药成本。作为新型兽药的开发这一项目有重要的学术价值和应用前景，同时具有较高的社会效益和经济效益。 　　本研究采用分子量大、反应条件温和的20 kΔ单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯（μ∏EΓ-∑X）修饰剂对重组猪α干扰素进行了修饰（图1），并通过控制反应条件，期望获得半衰期更长、更稳定，且体外活性保留较高的∏EΓ化重组猪α干扰素产物。且对该单修饰产物进行了纯度、体外抗病毒活性进行了检测，为进一步考察其药代动力学和药效学性质奠定了基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　原料：单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯（mPEG-SC），重组猪α干扰素。 　　仪器：Amersham Pharmacia公司的AKT A Explorer 色谱系统；北京六一仪器厂的DYY-Ⅲ -4稳压稳流电泳仪。 　　试剂：牛血清白蛋白；甲叉丙烯酰胺； 丙烯酰胺、SDS；考马斯亮蓝R250； RRMI 1640培养基；小牛血清； 其余试剂均为国产分析纯或生化纯试剂。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 聚乙二醇-重组猪α干扰素的制备与纯化 干扰素用5 mmol/L pH3.0～5.0的磷酸二氢钾缓冲液稀释到0.1 mg/mL；加入计算量的干扰素，用NaOH溶液调节pH到8.0，按干扰素：mPEG为1∶20的物质的量加入1/4量的mPEG-SC，在0～4 ℃条件下反应，随后每间隔2 h加入1/4量的mPEG-SC，加入完毕后继续反应4 h，加入0.75 mol/L的甘氨酸1 mL终止反应；随后将上述反应液用5倍量体积、浓度为50 mmol/L pH 7.2的醋酸钠缓冲液稀释，然后上Superdex 75 Highload制备型凝胶色谱柱（26 mm×600 mm， 22～24μm），以5倍体积pH 7.2的醋酸钠缓冲液洗柱后，用含0.5 mol/L NaCl的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含PEG-干扰素的洗脱液，浓缩，SDS电泳检测。用Superdex 200对“（1）”中得到PEG化干扰素进一步纯化，洗脱液为pH 7.2的醋酸钠缓冲液（含0.2 mol/L NaCl），用波长为280 nm的紫外吸收检测，收集含PEG-干扰素的洗脱液，浓缩。 　　1.2.2 SDS电泳法对产物的检测 对浓缩的各洗脱峰采用SDS电泳检测，分离胶10%，浓缩胶5%。电泳结束后，将胶体固定（固定液：30%甲醇、5%乙酸）室温摇动染色1 h（染色液：0.05%考马斯亮蓝、30%甲醇、5%乙酸）；最后将胶体移入脱色液（脱色液：1%戊二醛、30%甲醇、5%乙酸）中室温摇动浸泡直至条带清晰为止。 　　1