重组腺相关病毒介导IL32基因抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖机制研究.docVIP

重组腺相关病毒介导IL32基因抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖机制研究 　　[摘要]目的：探讨重组腺相关病毒介导的IL-32基因抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞（Keloid fibroblasts，KFs）增殖的机制。方法：用重组腺相关病毒介导的IL-32（rAAV2 IL-32）及腺相关病毒空载体感染人KFs，通过荧光显微镜观察rAAV2 IL-32的感染效率，RT-PCR法检测IL-32的转录水平；用MTT法检测KFs增殖的情况；用蛋白质印迹方法检测Bcl-2、BAX、TGF-β1的表达。结果：rAAV2 IL-32及腺相关病毒空载体感染KFs 48h后，RT-PCR检测显示rAAV2 IL-32组出现高表达电泳条带，而腺相关病毒空载体组则未出现电泳条带；MTT法检测显示rAAV2 IL-32组明显抑制了KFs的增殖；蛋白质印迹结果显示rAAV2 IL-32组KFs中Bcl-2、TGF-β1表达降低，BAX表达增高。结论：rAAV2 IL-32 可能是通过减少KFs中Bcl-2和TGF-β1的表达以及增加BAX的表达来抑制瘢痕疙瘩的增殖。 　　[关键词]白细胞介素32；瘢痕疙瘩；Bcl-2；TGF-β1；BAX 　　[中图分类号]R619+.6 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）11-1987-04 　　人白介素32 （interleukin-32， IL-32）最早于1992年由Dahl等[1]提出，2005年Kim SH等[2]研究发现其有多种炎症反应细胞因子的特性。目前研究证实IL-32不仅可诱导炎性细胞因子产生，而且在调节细胞增殖与凋亡中发挥重要作用[3]，临床上已经用于防治肿瘤和结缔组织疾病的研究 [4]。瘢痕疙瘩具有肿瘤样生长的生物学特性，是一种自身免疫性、炎症性疾病[5]。有关重组腺相关病毒介导的IL-32基因（rAAV2 IL-32）抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞（Keloid Fibroblasts，KFs）增殖的机制研究尚未见文献报道，由此，笔者通过构建IL-32基因重组腺相关病毒表达载体并转染KFs，研究IL-32基因对KFs增殖的影响及机制探讨，从另一角度认识瘢痕疙瘩的发病机制，可能从分子水平上为瘢痕防治提供新的思路。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料：rAAV2 IL-32及重组腺相关病毒空载体（广州莱德尔生物科技公司设计提供），KFs（广东医学院整形外科研究所），小牛血清和DMEM培养基（Gibco公司），MTT（Sigma公司），IL-32引物：IL32-F TCCCGAAGGTCCTCTCTGAT， IL32-R CATAATAAGCCGCCACTGTCT、BCL2引物：BCL2-F TCATGTGTG TGGAGAGCGTC，BCL2-R AGCCTCCGTTATCCTGGATC、BAX引物：BAX-F GATGCGTCCACCAAGAAGCT，BAX-R CGGCCCCAGTTGAAGTT G、TGF-β1引物：TGF-β1-FCACGTGGAGCTGTACCAGAA，TGF-β1-R GAACCCGTTGATGTCCACTT、18srRNA引物：18srRN A-F CCTGG ATACCGCAGCTAGGA、18srRNA-R GCGGCGCAATACGA ATGCCCC（上海生工生物科技有限公司合成）。人IL-32、Bcl-2、BAX、TGF-β1抗体（北京博尔迈生物技术有限公司）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 重组腺相关病毒载体rAAV2-IL-32的病毒滴度测定：应用CMV探针（地高辛标记）点杂交方法检测病毒液中rAAV2-IL-32的物理滴度（以病毒基因组数/ml，vg/ml表示）。准确定量质粒SV40，用稀释缓冲液（梯度稀释后）点样尼龙膜上；待测病毒液rAAV2-IL-32样品用DNase I和RNase稀释，终浓度均为1μg/ml，于37℃消化1h，提取rAAV2 DNA， 100℃水浴5min变性，置于冰浴中。按试剂盒说明以一定比例稀释缓冲液后点膜。按Boehringer Mannheim公司试剂盒说明书，再进行预杂交、杂交、洗膜、显色。通过计算IL-32的拷贝数、再乘以与其杂交信号强度一致的病毒液样品的稀释倍数而得出rAAV2-IL-32的物理滴度，滴度计算公式：滴度（v.g./ml）= 杂交信号对应的拷贝数×2×稀释倍数。 　　1.2.2 细胞培养：KFs的培养：含10%小牛血清的DMEM培养基，置于CO2培养箱内（37℃，5% CO2）培养。当细胞铺满瓶底时进行消化、传代。实验用3～4代细胞。 　　1.2.3 荧光显微镜观察rAAV2-IL-32感染效果：按照常规方法扩增腺相关病毒，分别以感染复数（MOI）103，104，105的比例感染KF