重组酿酒酵母磷酸胆碱胞苷转移酶基因工程菌稳定性研究.docVIP

重组酿酒酵母磷酸胆碱胞苷转移酶基因工程菌稳定性研究 　　摘要：为了进一步研究基因工程菌E.coli B121（DE3）/pET-29a-cct在培养基中传代50次过程中菌种的稳定性，通过将菌体和菌落的形态、质粒的稳定性、质粒酶切图谱和重组CCT酶的表达量及活性作为指标进行考察，来评价该工程菌的稳定性。结果显示，重组CCT酶基因的工程菌在转接50次的过程中质粒稳定性高，其保有率为90%，表达产物可达发酵液总蛋白的15%以上。该菌在第50代后仍具有转化活性，说明工程菌转化活性稳定。 　　关键词：磷酸胆碱胞苷转移酶（ccT酶）；质粒稳定性；工程菌稳定性；转化活性 　　中图分类号：Q939.9 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0049-02 　　大肠杆菌遗传背景清楚，生长迅速，发酵周期短，是基因工程的主要受体菌，已得到广泛应用。然而，克隆有外源基因的重组质粒转化到大肠杆菌细胞之后，会产生一系列的负面生理效应，从而影响其稳定性。外源基因表达后，增加了细胞的代谢负担，质粒稳定性会下降。一般来说，丢失质粒的细胞往往比含有质粒的细胞具有更高的生长速率。基因工程菌的质粒不稳定现象在生产实践中普遍存在，这导致对它的应用受到一定的限制。通常质粒稳定性的高低是影响发酵产量的重要因素，质粒丢失会导致所表达的蛋白产量下降，进而影响发酵产物的收率，还可能造成较大的经济损失。 　　磷酸胆碱胞苷转移酶（CCT酶）可直接催化胞苷三磷酸（CTP）和磷酸胆碱合成胞二磷胆碱。在之前的研究中，本课题组已克隆到酿酒酵母磷酸胆碱胞苷转移酶基因（cct）并插入表达载体pET29a（+）中，成功构建了重组工程菌E.coliBL21（DE 3）/pET-29a-cct，获得了具有催化活性的工程菌株。该工程菌株具有较好的工业应用前景，为确保生产中菌种的稳定性，进一步对该重组工程菌的稳定性进行研究具有相当重要的实际意义。 　　1.材料与方法 　　1.1材料和培养基 　　重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-29a-cct由江苏省中国科学院植物研究所分子实验室构建。除发酵培养基外，使用的皆为LB培养基，发酵培养基配方：Na2HPO4?12H2O24.0g，KH2PO4 4.9g，NaCl0.5g，MgSO4?7H2O 1.0g，CaCl20.1g，酵母粉5.0g，蛋白胨5.0g，pH值调至7.2，121℃灭菌20min. 　　1.2方法 　　1.2.1菌种的传代将保存于-80℃冰箱中的原始菌株大肠杆菌BL21（DE3）/pET-29a-cct划线于含卡那霉素（50ug/mL）的LB固体培养基上，再挑取单菌落接种于液体培养基中，37℃振荡过夜。按1%接种量将过夜培养物转接于不含抗生素的lJH液体培养基中，37℃培养12h，每转接1次计传代1次，共转接50次。分别取第10、20、30、40、50次的转接培养物500uL，加入甘油（终浓度为30%），保存于-80℃冰箱中，备用。 　　1.2.2工程菌形态的观察取样后菌体用生理盐水洗涤3次后，再用少量的生理盐水悬浮。制片并进行革兰氏染色，于光学显微镜下观察。 　　1.2.3平板稀释计数法将连续摇瓶培养试验转接的第10、20、30、40、50代取样进行平板稀释检测质粒的缺失程度。检测时，取菌液1mL用无菌水逐级稀释，取3个合适的梯度，分别涂在固体选择性培养基和非选择性培养基平板上，每个处理3次重复。倒置在37℃培养箱中培养过夜，计算培养皿中的菌落数，根据选择性培养基中的菌落数与非选择性培养基中菌落数的比值，即可计算出质粒的缺失率。 　　1.2.4质粒酶切图谱的鉴定采用碱裂解方法从第10、20、30、40、50代菌体中提取质粒，0.75%琼脂糖凝皎电泳检测。为确定CCT酶编码基因的稳定性，进一步将各代菌所提质粒用限制性内切酶Nde 和Xho I进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测。 　　1.2.5重组CCT酶的表达稳定性及酶活鉴定取0、10、20、30、40、50代菌种，分别接种于液体lJH培养基中，37 qC振荡过夜培养，转接于新鲜的发酵培养基中，37℃培养3～5h，加入IPTG（终浓度为1mmol/L）30℃诱导表达10h，取1mL菌液，于12000r/min离心2min，收集菌体并重悬于500uL1×SDS加样缓冲液，沸水浴中煮沸10min以充分裂解细胞，12000r/min室温离心10min，使细胞碎片及DNA等沉淀，取适量溶液上样，SDS分析。粗酶液制备及酶活测定方法参照文献[3]。 　　2.结果与分析 　　2.1工程菌形态 　　将取样的各代菌体进行革兰氏染色，光学显微镜下可见形态均匀一致的革兰氏阴性短杆菌，划线培养未见杂菌生长，菌体和菌落的形态均正常。 　　2.2种子液选择