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重组腺病毒表达IL6基因对大鼠缺血保护作用 　　摘要：目的 构建携带白细胞介素－6(IL-6)基因的腺病毒载体Ad－IL6，在大鼠脑缺血模型中观察外源基因IL-6的表达对脑缺血损伤的影响。方法 RT-PCR扩增人IL-6cDNA序列，构建携带IL-6基因的腺病毒载体，在293细胞中重组腺病毒Ad-IL6；通过夹闭双侧颈总动脉合并低血压以减少脑血流量，制备急性脑缺血大鼠模型；分别在术前、术后尾静脉注射Ad-IL6，观察大鼠神经症状，进行神经功能评分和脑组织病理观察。结果 以健康成年人血液单个核细胞成功扩增出IL-6 cDNA序列，并在293细胞中重组出腺病毒Ad-IL6；以1×109pfu/200μL的病毒剂量治疗，术前治疗组、术后治疗组和手术无治疗组大鼠的神经症状评分较假手术组高，脑组织出现病理损伤；术前治疗组大鼠的神经症状评分较术后治疗组和手术无治疗组低，脑组织病理损伤轻；而术后治疗组评分略高于手术无治疗组，但无统计学意义。结论 IL-6对中枢神经系统具有神经毒性及神经营养、神经保护双重作用。损伤前IL-6的正常或高水平表达状态对随后的神经损伤可起到一定保护作用，但在体内神经损伤激活了免疫反应后增加IL-6的表达，则起到加重损伤的负面效应。 　　关键词：白细胞介素-6；腺病毒；神经损伤；神经保护；大鼠 　　中图分类号：R743 R285.5　文献标识码：A　文章编号：1672-1349(2007)12-1214-03 　　 　　白细胞介素－6(interleukin－6，IL－6)是由巨噬细胞、单核细胞、T细胞、B细胞等多种细胞分泌的一种多肽物质，具有广泛的生物活性，可作用于多种靶细胞，除参与机体的炎症反应和抗感染防御机制外，还与自身免疫疾病密切相关。研究表明，IL-6在脑血管病的发病过程中起重要作用。国外通过转基因小鼠脑内过度表达IL-6的实验，发现IL-6可引起神经元的退行性变，从而导致严重的神经性疾病。但也有实验证明，IL-6可通过刺激星形胶质细胞的活化增殖及合成神经营养因子而发挥神经保护功能，其本身也具有神经营养因子的类似作用，可诱导神经细胞分化生长，发挥促神经修复作用。鉴于IL-6在中枢神经系统缺血损伤过程中的作用尚未完全阐明，还存在着互相矛盾的结果，有必要进行更深入的研究。本项研究克隆IL-6基因，构建携带IL-6基因的腺病毒载体Ad-116，同时建立急性脑缺血损伤大鼠动物模型，在大鼠脑缺血损伤发生的前后，给予Ad-IL6灌注，继而观察外源基因IL-6的表达对脑缺血损伤转归和预后的影响。力求阐明IL-6在心脑血管疾病的作用和意义。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1．1 材料来源 腺病毒载体质粒购自Microbix Biosystem公司，内切酶购自NEB公司，293细胞系来源于中科院上海细胞所，Wistar大鼠来源于中科院上海动物所，Ltipo Factamine2000转染试剂盒、Trizol试剂盒、一步法反转永POR试剂盒为LifeTechnologies产品。引物由上海申能博彩生物公司合成。 　　 　　1．2 携带IL－6的腺病毒载体的构建 根据GeneBankBC015511的基因序列，合成IL－6 cDNA引物，由上海博彩生物公司合成。上游引物：5’－cgg aat tcg CCC agc tat gaa ctc ctt ctcCaC-3，下游引物：5’-gcg teg act gec ot get aca tn gcc gaa gag-3’。上下游引物引入EcoRI和SalI位点。 　　取健康成年人血6 mL，分离单个核细胞，采用TrlxD试剂提取总RNA。以总1LNA2μg为模板，RT-PCR扩增人IL-6cDNA序列，扩增片段大小671bp。回收扩增产物，EcoRI+San酶切后，插入T载体，送上海申能博彩生物公司测序。 　　经测序证实后，EcoRI+SalI酶切T载体，回收661bp的酶切片段，插入到腺病毒载体pDC315中，经酶切和PCR鉴定正确后，与pBHGIoxddEl3ere一同转染293细胞，具体方法参见转染试剂盒操作说明书。共转染后12 d出现病毒空斑，经过空斑纯化，得到重组腺病毒Ad-IL6。采用IL-6 cDNA特异性引物进行腺病毒的鉴定。 　　 　　1．3 构建动物模型 参考文献[6]方法制备大鼠脑缺血模型。雄性Wistar大鼠20只，体重300g±50g，用10％水合氯醛腹腔注射麻醉(0.75g/kg)。取仰卧位，无菌条件下分离两侧颈总动脉并分别置线备用。麻醉术中及术后清醒前，用烤灯维持动物体温在37.0℃±0.5℃。实验分4组，术前治疗组、术后治疗组、手术无治疗组和假手术组，每组5只。术前治疗组、术后治疗组和手术无治疗组，用动脉夹通过夹