野生铁皮石斛内生菌分离及促生作用研究.docVIP

野生铁皮石斛内生菌分离及促生作用研究 　　摘要试验从野生铁皮石斛根、茎中分离获得内生细菌10株、内生真菌21株。以菌液制剂分析其对组培铁皮石斛的促生作用,经筛选及验证,结果表明:内生细菌ZJSH1对铁皮石斛组培苗具有显著的促生作用,且培养液稀释102倍后促生效果最佳。 　　关键词铁皮石斛;内生菌;分离;促生作用 　　中图分类号S567.23+9文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)09-0096-02 　　 　　Separation and Growth-promoting Study of Endophyte in WildDendrobium candidum 　　YU JieZHAOKai-pengDONG FeiCHENG Li-mei XIAO Sai-qiongQIU Dong-meiHU Xiu-fang * 　　(Institutes of Bioengineering, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou zhejiang 310018) 　　AbstractPlant endophyte strains were isolated from roots and stems of Dendrobium candidum,10 of them was bacterium,and 21 was fungi. Growth-promoting test was carried out through inoculating endophyte suspension into seedlings of plant tissue culture. The results indicated that ZJSH1 could promote the growth of Dendrobium candidum apparentely,and the best effect was abtained with nutrient solution diluted 100 times. 　　Key wordsDendrobium candidum;endophyte;separation;growth-promoting 　　 　　铁皮石斛(Dendrobium candidum Wal1.ex Lindl.)属气生兰科草本植物[1],是我国传统名贵中药,具有滋阴补虚、防癌抗癌、补精补血、增强人体免疫力、抗衰老等治疗和保健双重功效[2]。铁皮石斛以其极大的药用价值,成为全国涉及石斛类用药的制药厂和保健品加工企业的原料命脉。然而由于生长环境改变、化学农药频繁使用等因素,野生铁皮石斛濒临灭绝[3],且其人工栽培存在繁殖育苗慢、移栽成活率低、生长周期较长等技术难题[1],始终难以取得突破性进展。近年来研究表明,兰科植物的内生菌(Plant endophyte)能与宿主形成互利共生关系,从而促进宿主生长和发育[4]。因而,特研究铁皮石斛的内生菌,以获得对其生长具有显著促进作用的菌株,为研究铁皮石斛促生菌剂提供理论基础,也为解决铁皮石斛生长问题提供一个现实途径。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　供试野生铁皮石斛取自浙江桐庐。铁皮石斛组培苗由浙江省桐庐铁皮石斛生产基地通过组织培养获得。分离培养基:马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)(去皮马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,H2O 1 000 mL,pH值自然);马铃薯蔗糖液体培养基(PD)(去皮马铃薯200 g,葡萄糖20 g,H2O 1 000 mL,pH值自然);牛肉膏蛋白胨培养基(NA)(蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl 5 g,琼脂15~20 g,H2O 1 000 mL,pH值为7.4~7.6);牛肉膏蛋白胨液体培养基(蛋白胨10 g,牛肉膏3g,NaCl 5 g,H2O 1 000 mL,pH值为7.4~7.6)。组培培养基:1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+10%香蕉汁+2%蔗糖+8 g/L琼脂。 　　1.2试验方法 　　1.2.1野生铁皮石斛内生菌分离。流水冲洗野生铁皮石斛外表皮,用25 kHz超声波清洗5 min后,移入无菌超净台,用无菌水冲洗2次,每次约1 min,再用75%酒精消毒20 s,3%次氯酸钠溶液消毒4 min,最后用无菌水冲洗3次。茎去皮或直接切成0.5~1.0 cm小段,根切成0.5~1.0 cm小段,分别置于PDA和NA平板上,每平板5小段,每处理重复5次。PDA平板置于25 ℃恒温培养箱培养3~7 d,NA平板置于30 ℃恒温培养箱培养2~3 d。观察组织小段周围长出的菌落,挑取真菌菌落最外延端并转接至PDA平板中纯化,挑取细菌转接至