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金属硫蛋白检测方法及其应用 　　摘要 金属硫蛋白（MT）是一种普遍存在、富含金属和半胱氨酸的低分子量蛋白质，主要包括Ag、Au、Bi、Cd、Hg、Zn等硫蛋白，MT具有在体内可被金属和其他因素诱导合成的生物学特性。ELISA以其灵敏度高、特异性强且测定相对迅速、方便、无需特殊昂贵的仪器设备、无放射性同位素的污染等特点成为MT定量检测的理想方法。MT在与金属有关的动物机体的生理学研究、某些微量元素营养性缺乏症的诊断、治疗以及保护环境等方面起着重要作用，随着对MT研究的日益深入，不断对ELISA方法的改进，利用ELISA检测MT有着广阔的前景。 　　关键词金属硫蛋白；检测方法；应用 　　金属硫蛋白（Metallothionein）是一类富含半胱氨酸残基和金属的小分子蛋白质物质，简称MT，又叫金属硫氨酸甲基内盐。主要存在于动物的肝脏、肾脏、胰腺和小肠中，因动物的不同，其分布和半衰期略有差异[1]。其研究和开发涉及农业、医药保健、生物工程、环境保护等各个领域[2]。 　　 　　1MT的一般性质 　　 　　根据与MT结合的金属种类、摩尔含量来分别命名，如Cd-MT、Cu-MT或Cd7-MT、Zn7-MT（表示每个分子中结合7个原子Cd或Zn）或Cd、Zn-MT这类形式。也可用罗马数字和小写字母标出分子结构的差别，如人MT-Ⅰb、MT-Ⅱa等。MT的三级结构由α结构域（羧基末端后30个氨基酸残基）和β结构域（氨基末端前30个氨基酸残基）构成，分子呈哑铃形。每个区域有4个Cys巯基结合金属原子。等电点PI一般在4左右。分子量范围较大，为2 000～13 800Da，其中哺乳动物的MT分子量为6 000～7 000Da。分子中不含芳香族氨基酸，没有280nm的吸收峰，与不同金属结合产生不同特征吸收峰，脱掉金属后，硫蛋白在190nm处有一明显的肽键吸收峰。 　　MT的金属具有动力学不稳定性，巯基具有亲核性，决定了MT易与某些亲电物质特别是某些自由基相互作用，消除辐射形成的?OH自由基。MT具有抗应激作用，如动物注射糖皮质激素、干扰素、白细胞介素－Ⅰ后，肝脏中的MT合成增加；各种炎症因子及机体的应激状态（如寒冷、过度疲劳、饥饿等）都增加MTmRNA的转录。并且MT可保护细胞抵抗重金属和烷化剂的致癌、致突作用[3]。重金属（Cd、Zn等）可使MT合成速率增加，可防止Zn和Cu、Hg中毒。但MT并不是对所有能诱导它合成的金属都具有解毒作用，如Ag、Au、Co和Ni都能诱导MT的合成，却不对这些金属有解毒作用。另外在细胞内，Cd-MT具有保护作用，但在细胞外，Cd-MT具有比Cd2+本身更大的肾细胞毒性[4]。 　　 　　2MT的检测方法 　　 　　对MT检测方法的研究已有多年，其检测方法大多是建立在MT的理化特性和免疫学特性基础上的。 　　2.1免疫法 　　正常人血清、尿的MT含量为0.01～1.00ng/mL，一般不超过2.0～10.0ng/mL，MT量如此低微，很多方法均无法满足检测要求，免疫法具有灵敏、特异的优点，故近年来学者们尝试建立放射免疫分析法（RIA）和酶联免疫吸附法（ELISA），以用于MT的定量检测。 　　2.1.1放射免疫分析法（RIA）。1979年，Mallie等首先建立RIA，用来检测大鼠MT。随后Mulder等于1990年，利用人MT（没有注明MT的亚型）建立测定人体液MT含量的RIA，并发现抗体来源和特性不同，所呈现的结果也不同，体现了高度特异性的优点。但该法由于使用的放射性同位素，具有放射性污染，且在测量时需昂贵专用仪器，测定成本较高。 　　2.1.2酶联免疫吸附法（ELISA）。1986年，Thomas等建立的荧光ELISA的灵敏度与RIA相似，但在测定血清中的MT时，ELISA受血清蛋白的干扰，其灵敏度有所下降。Akintola等（1995）建立了测定人血浆和尿液中MT含量的ELISA法，其灵敏度达5.0ng/mL[5]。Van等发现抗体的特异性与MT所含的金属离子种类有关，所建立的ELISA可检测出60pg的人胎肝MT[6]。还有学者通过合成某一段特异的肽链，免疫动物制备表位特异性抗体建立ELISA来检测不同亚型的MT[7]。郑军恒、茹刚等人（1999）发现用直接ELISA方法可检测较纯的样品，竞争型ELISA方法可测定较粗的样品中MT的含量[8]。张亨山、赵金恒等（2000）组建的双抗体夹心ELISA的灵敏度为20.0ng/mL，用于测定人体MT也有较好的灵敏性和可靠性[9]。黄波等（2000）引入生物素－亲和素系统建立的竞争型ELISA，测定人尿MT，灵敏度达到2.5ng/mL，比夹心ELISA（20.0ng/mL）和ELISA－线性伏安法（5.0ng/mL）要低，且该法具有较