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中国卤虫Cav1基因同源性与系统进化分析 　　摘要：窖蛋白-1是胞膜窖的主要结构蛋白，可参与调节细胞增殖和分化，细胞凋亡和肿瘤发生等生理过程，是多种信号通路串话的中心。。本实验通过RT-PCR技术得到卤虫Cav-1基因的部分序列并进行生物信息学分析。结果表明卤虫的Cav-1蛋白与脊椎动物具有相同的生理功能，并在无脊椎动物到脊椎动物的稳步进化中高度保守。 　　关键词：卤虫Cav-1；同源性；系统进化 　　 　　胞膜窖（caveolae）又称膜内陷囊泡，通常单一或成簇组成直径50-100nm的小窝。胞膜窖主要分布于分化型细胞中，比如脂肪细胞，内皮细胞，平滑肌细胞，心肌细胞等。窖蛋白-1（Cav-1）作为胞膜窖的标准蛋白分子使许多信号分子能够聚集在窝内，如多种受体酪氨酸激酶，非受体酪氨酸激酶，G-蛋白偶联受体，eNOS等，从而具有维持胆固醇平衡，信号转导，物质转运，控制细胞生长和参与癌症相关信号通路等多种功能。 　　卤虫在分类上属于节肢动物门，甲壳纲，鳃足亚纲，无甲目，卤虫科，是一种小型水生动物。它具有广温耐高盐的特性，生活在内陆盐湖和沿海盐田内，不仅生活周期短，繁殖快，适应能力强，休眠卵可以长期保存随时孵化，而且营养价值高，富含各种氨基酸和脂肪酸，多年来一直被人们用于水产养殖业中鱼虾蟹类幼虫的优质开口饵料。 　　Cav-1在肿瘤发生过程中是细胞增殖，细胞凋亡等信号通路的中枢研究已相当深入，但却没有在卤虫的研究。卤虫进化地位较低，本研究的任务是确定中国卤虫中是否存在Cav-1基因，并确定它与脊椎动物相似性及进化过程。同时，卤虫又是海产养殖中的经济饵料，价格一度堪比黄金，因此研究卤虫发育过程具有极高的经济效益。 　　1、材料与方法 　　实验材料来自山西运城，卤虫卵在恒温光照培养箱中海水孵化。Trizal法提取卤虫总的RNA在逆转录酶的作用下反转录，-20℃保存。 　　1.1 Cav-1基因中间片段的扩增 　　从NCBI数据库中，查找A．frannciscana中窖蛋白家族成员，用Primer Primer5.0软件设计引物，委托宝生物工程有限公司合成，上游：5-AAATCGGCCTCTCGCGCTGG-3，下游：5-TGTGCAGCATCAGGCTCGGC-3，58℃退火，琼脂糖凝胶检测PCR产物。 　　1.2 生物信息学分析 　　将得到序列在NCBI数据库中Blast X比对，下载比对结果中出现的其他物种的Cav-1的氨基酸序列，与卤虫的Cav-1蛋白做ClustalX比对。然后用MEGA4.1软件对已知物种Cav-1的氨基酸序列做进化树分析。 　　2、结果与讨论 　　2.1 Cav-1基因中间片段扩增产物 　　琼脂糖凝胶检测PCR产物，切胶回收，经克隆测序得到卤虫Cav-1基因序列的一段350bp的序列，经BlastX同源性分析确定为所要的目的基因片段，可用于后续实验分析。 　　 在NCBI上用Blast X软件对所得序列进行简单同源性分析，中国卤虫与其他物种的同源性较高，达到40%-55%。将对应的氨基酸序列放入NCBI的保守结构域查找在线软件中，确认这段序列所表达的蛋白片段中包含caveolin超家族结构域。 　　2.2 同源性比对分析 　　中国卤虫的Cav-1基因序列的BlastX同源性比对结果表明，中国卤虫与其他物种的Cav-1具有较高的同源性，其中与同属于甲壳纲肢角类的蚤状??Daphnia pulex氨基酸同源性最高达到了55%，与高等脊椎动物同源性也在40%左右。 　　Cav-1具有一个极为保守的特异性基序，在做功能域的的motif分析时，我们找到位于卤虫第110-117位残基的FEDVIAEP氨基酸序列，并在ClusatlX比对结果中发现，所有物种的Cav-1蛋白都具有此序列，并高度保守。Cav-1最具特征的区域应该是位于82-101位的特异性氨基酸序列：DGIWKASFTTFTVTKVWFYR，它可以特异性的识别并结合下游信号因子，称为Cav-1脚手架区CSD。用ClustalX软件进行完全比对，找到中国卤虫Cav-1中与其对应的序列为：EAIWRGVFLIFTGVRFWAYR，它位于卤虫caveolin-1的124-143位氨基酸残基。此部分20个氨基酸残基中，存在不一致的位点，经过分析发现虽然氨基酸发生了替换，但不会对二级和三级结构造成太大影响。由此可猜测，中国卤虫的124-143位氨基酸残基在行使功能时起到了脚手架区募集信号分子的作用。 　　2.3 系统进化树的构建 　　为了更清楚的了解中国卤虫Cav-1基因的进化地位，我们用MEGA4.1软件构件系统发育树，用NJ法对Cav-1做进化树分析，结果表明，14个物种的Cav-1蛋白被分为明显的两大簇，即中国卤虫A.s