生物化学课程基因诊断教学课件.ppt

* PCR：PCR/ASO, PCR/SSCP, PCR/sequencing, PCR/RFLP ASO诊断单个的基因突变。 * * * * * * 。 * * * * * * * * * (五)基因诊断在判断疾病易感性中的应用 （六）基因诊断在器官移植组织配型中的应用 * DNA指纹法 （DNA fingerprints） 提取人基因组DNA，用限制性内切酶切成不同长度的片段（各种VNTRs上都没有酶切位点），然后以VNTRs中的特异序列为探针进行Southern杂交，可发现阳性片段的长度各不相同。 由于不同个体的这种串联重复的数目和位置都不相同，所以VNTRs的Southern杂交带谱就具有高度的个体特异性，称其为DNA指纹，可用于亲子鉴定、法医鉴定等。 亲子鉴定 A和C是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；D为养女。 DNA指纹分析法 ①一个DNA指纹探针可同时检测十几个，甚至几十个位点的变异，因而DNA指纹更能反映基因组的特异性； ②具有高特异性，只有同卵双生子女才会有完全相同的指纹； ③具有稳定的遗传性，通过家系分析表明，DNA指纹谱中几乎每一条带都能在双亲之一的指纹谱中找到，而产生新带的概率仅为0.001%~0.004%之间； ④DNA指纹图谱具有体细胞稳定性，即从同一个体中不同组织、血液、肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹完全一样。 单核苷酸多态性标记 (single nucleotide polymorphysm, SNP) 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。 SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。 SNP结合DNA芯片技术的方法将成为法医学鉴定中一种很有前景的新方法。 小 结 基因诊断的概念 常应用核酸分子杂交、PCR、DNA序列测定、DNA芯片等技术。 基因诊断的方法主要包括：①基因突变的检测；②多态性分析；③基因表达异常的检测；④外源基因的检测。 基因诊断已广泛应用于遗传病、感染性疾病、肿瘤的诊断及法医学等领域 谢谢大家！ * * * * * * * * * * * * * * * Molecular hybridization：Southern, Northern, slot blot, FISH, ASO, microarray 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。 互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。 * 探针：一段能与待测核酸片段互补结合、经过特殊标记的特异核苷酸序列【探针可以进行放射性标记物（放射自显影）32P，35S，125I，3H；非放射性标记 * * * * * * * * PCR技术的优点 特异性强 灵敏度高 操作简单、省时 对待检原始材料质量要求低 高效率的基因扩增技术 DNA-PCR RT-PCR 多重PCR (multiplex PCR） 套式PCR （Nested PCR） 原位PCR Real time PCR PCR的种类 PCR扩增产物分析法 凝胶电泳 PCR/点杂交 (PCR/ASO等位基因特异性寡聚核苷酸) PCR/SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism） PCR/RFLP (restriction fragment length polymorphism,?RFLP) PCR/sequencing PCR扩增产物分析 疑胶电泳分析法 通过凝胶电泳检测扩增产物片段大小，若特异扩增出一条带，该法即可判断结果。 注意平行对照： DNA分子量标准物 阳性对照 阴性对照 内参照 限制性酶切分析法 设计的引物，使扩增片段包括某一种或数个限制酶识别序列，PCR反应后用限制酶消化扩增产物，电泳检测酶切片段长度的变化。 PCR扩增产物分析 采用能与扩增产物内部核苷酸序列互补的寡核苷酸探针，实施斑点杂交或Southern印迹杂交当扩增产物出现多条带时，适用该法。 核酸杂交法 PCR扩增产物分析 Allele-specific oligonucleotide， ASO 当基因的突变部位和性质已完全明了时，人工合成两条寡核苷酸探针，其