BRG1在肺癌组织与肿瘤细胞系中表达下调原因初探.docVIP

BRG1在肺癌组织与肿瘤细胞系中表达下调原因初探 　　关勇军　蔡秀梅　李友军　何春梅　陈主初 　　摘要：前期的研究表明：在肺癌及多种肿瘤细胞系中，BRG1(brahma-related gene 1)的mRNA和蛋白质表达下调或缺失，但影响BRG1表达下调的原因并不清楚，因此，用PCR-SSCP(single strand conformation polymor-phism)方法检测18例肺癌组织和15株肿瘤细胞系DNA，并经测序证实：其中有1例肺癌组织的BRG1外显子25第3590位碱基存在T→C的点突变，其编码的BRGI蛋白第1171位氨基酸相应地由Val(缬氨酸)→Ala(丙氨酸)，该突变位于BRG1蛋白最重要的功能区(依赖DNA的ATP酶区)，提示BRG1突变在肺癌发生中可能起一定的作用，同时，对未检测到BRG1 mRNA表达的6例肺癌组织和9株肿瘤细胞系还进行了DNA甲基化分析，结果发现：这些肺癌组织和肿瘤细胞系中BRGI启动子区均无异常甲基化，这说明BRG1在肺癌中表达下调的机制尚需进一步研究。 　　关键词：BRG1；肺癌；突变检测；甲基化分析 　　中图分类号：R730 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007-7847(2007)02-0153-05 　　 　　BRG1(fbrahma-related gene 1)是进化上高度保守的SWI/SNF染色质重塑复合物的成员之一，我们和其他人的研究均发现：在肺癌组织及多种肿瘤细胞系中，BRGI的mRNA与蛋白质表达下调或缺失，但影响BRGl在肺癌中表达下调的原因仍不清楚，我们采用PCR和PCR-SSCP方法对肺癌组织和多种肿瘤细胞系进行检测，为阐明BRG1在肺癌中表达改变的机制提供证据。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1细胞与组织 　　永生化人支气管上皮细胞系HBE，肺鳞癌细胞系NCI-H520，肺腺癌细胞系A549，鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、HNE1、HNE2、HNE3、HONE1，宫颈癌细胞系Hela，喉癌细胞系Hep-2，肾癌细胞系RLC和肝癌细胞系SMMC由本室提供，18例原发性肺癌组织取自中南大学湘雅二医院经病理确诊且未经放疗和化疗的患者，其中肺鳞癌12例，小细胞癌3例，腺癌、腺鳞癌和大细胞癌各1例。 　　 　　1.2主要试剂 　　Toq DNA聚合酶(大连宝生物工程公司)，限制性内切酶Msp Ⅰ和HpaⅡ(MBI公司)，蛋白酶K、SDS(Sigma公司)，小牛血清、RPMI1640培基(GIBCO公司)，胰酶、ADNA/HindⅢ和PCRmarker、琼脂糖等(华美生物工程公司)，全部引物用Primer3软件设计，由上海生工生物工程公司合成，引物序列和产物大小见表1.1，3方法1.3，1 DNA抽提。 　　细胞／组织DNA的提取参照文献[6]的方法进行，1，3，2纯合性缺失检测。 　　以提取的组织和细胞系基因组DNA为模板，分别用6对引物PCR扩增STSI。6片段[7]，反应结果用琼脂糖凝胶电泳进行检测，1，3，3点突变检测fPCR-SSCP)。 　　以提取的组织和细胞系的基因组DNA为模板进行PCR反应，以鼻咽癌细胞系CNE2基因组DNA为模板扩增p53基因第8号外显子(已知CNE2细胞中p53基因外显子8第280位密码子存在G～C错义突变)，作为阳性对照，PCR产物与等量变性缓冲液(97％去离子甲酰胺，0，2 mmol／L EDTA，0，05％溴酚蓝，0，05％二甲苯青FF)混匀，99℃变性10 min，置冰上骤泠，迅速上样于8％-12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺：双叉丙烯酰胺=49：1，凝胶厚度0.4 mm)，4℃，200V，电泳10～12h，卸下凝胶，于固定液(10％乙醇，0.5％冰醋酸)中浸泡10min，染色液(0.2％硝酸银)15min，蒸馏水漂洗2次，置显色液(0.75％NaOH和0.2％甲醛)中显色直至出现清晰的DNA条带，玻璃纸包裹凝胶，室温干燥保存。 　　1.3.4甲基化分析 　　甲基化分析采用Kane等描述的方法进行，已知BRGl表达下调的6例肺癌组织和9株肿瘤细胞系基因组DNA采用常规蛋白酶K消化、酚／氯仿抽提，1μg基因组DNA分别用100u的HpaⅡ或200 u的Msp I，37℃消化过夜，酶切产物纯化后，取40ng纯化的酶切产物用于PCR扩增，未消化的基因组DNA作对照，30μL PCR反应体系：1xPCR缓冲液、0.2 mmol／LdNTPs、1uTaq酶、0.4 txmol／L甲基化分析引物，94℃5 min预变性，94℃50 s、55℃50 s、72℃50 s，30个循环，PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。 　　 　　2实验结果 　　 　　2.