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独角雪冰鱼和伯氏肩孔南极鱼HSP70和HSP90β基因的克隆、序列分析以及低温适应性研究-海洋科学专业论文
上海海洋大学学位论文原创性声明
本人郑重声明:我恪守学术道德,崇尚严谨学风。所呈交的 学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的 成果。除文中已经明确注明和引用的内容外,本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为 本人亲自撰写,我对所写的内容负责,并完全意识到本声明的法 律结果由本人承担。
学位论文作者签名: 日期:2015 年 6 月 12 日
上海海洋大学学位论文版权使用授权书
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本学位论文属于
保密 □ ,在 年解密后适用本版权书。
不保密 √□
学位论文作者签名: 指导教师签名:
日期:2015 年 6 月 12 日 日期:2015 年 6 月 12 日
独角雪冰鱼和伯氏肩孔南极鱼 Hsp70 和 Hsp90β 基因的克隆、
序列分析以及低温适应性研究
摘 要
南极冰鱼(Channichthyidae,white-blooded fish)是南极鱼亚目中的一个家族, 长期生活在寒冷、稳定、富含氧气的南冰洋水域中,因没有血红蛋白而成为硬骨 鱼中的独特类群。南极冰鱼独特的形态学和生理学特征,为我们研究低温环境中 生物的功能基因进化以及生物的低温适应机制提供了条件。
热激蛋白(Heat shock protein, HSPs) 是细胞在应激源刺激下生成的一组蛋白 质,存在于几乎所有生物体内。HSP70 和 HSP90 是 HSPs 家族的重要成员,即 使在无胁迫条件下,真核生物内也有一定量的表达,在进化过程中高度保守。 HSP70 和 HSP90 作为分子伴侣,在细胞周期调控、细胞存活、激素等许多信号 通路中发挥作用,对于维持细胞的内稳态起到关键作用,同时在动植物的发育、 抗病、对胁迫环境的应答、抵抗外界环境变化的过程中发挥重要作用。
南极环境常年保持持续不变的低温。有研究认为,在这种长期的低温条件下, 热激蛋白已基本丧失温度适应???功能。为研究南极极端低温环境条件下,热激蛋 白是否还保存着温度适应功能,本研究运用 PCR 及二代测序技术获得了独角雪 冰鱼(Chionodraco hamatus)和伯氏肩孔南极鱼(Trematomus bernacchii)的 HSP70 和 HSP90β 完整的开放阅读框(ORF, opening reading frame),并结合生物信息学方 法进行了基因结构与保守功能域等生物学特性研究。两者的 Hsp70 的 ORF 全长 为 1917 bp,Hsp90β 的 ORF 全长为为 2184 bp,分别编码 638 个和 728 个氨基酸。 结构域分析发现独角雪冰鱼和伯氏肩孔南极鱼的 HSP70 都含有 HSP70 家族的两 个标签序列和 C-端 GPTIEEVD 保守基序。HSP90β 具有 HSP90 家族的 5 个保守 信号区和 C-端 MEEVD 基序,且一些 HSP90 功能区的关键位点高度保守。同源 性分析表明独角雪冰鱼 HSP70 和 HSP90β 与其他物种的相似度很高,其中与南 极伯氏肩孔南极鱼的蛋白相似度高达 99%。
为研究独角雪冰鱼 HSP90β 在低温胁迫下对细胞是否具有保护功能,构建
pET28-CH-Hsp90 和 pET28-ON-Hsp90 重组原核表达质粒,将重组质粒和空载体
I
pET28a 分别转化大肠杆菌 DE3(BL21)细胞,于 37℃条件下表达后,将大肠杆菌 细胞进行 4℃低温处理,比较经过低温处理后的大肠杆菌(DE3)细胞存活率。 结果显示:低温处理 4 h 后,C. hamatus-HSP90β 组与 O.niloticus-HSP90β 组和空 载体对照组没有显著性差异;8 h 时,C.hamatus-HSP90β 组细胞存活率高于 O.niloticus-HSP90β 组和 pET28a 空载质粒(control)组,其中 C.hamatus-HSP90β 组和 O.niloticus-HSP90β 组存在显著性差异(p﹤0.05),C.hamatus-HSP90β 组与 pET28a 空 载 质 粒 ( control ) 存 在 极 显 著 性 差 异 ( p ﹤ 0.01 ); 12 h 时 C.hamatus-HSP90β 组与 O.niloticus-HSP90β 组和 pET28a 空载质粒(control)组 都存在极显著差异(p﹤0.01),这说明独角雪冰鱼(CH)和尼罗罗非鱼
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