血清γ-球蛋白的分离-夏洪课件.ppt

* 血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定 指导教师：夏 洪 李 晓 梅 本次实验内容 （一） 血清γ-球蛋白的分离与纯化 （二） 血清γ-蛋白的鉴定 —— 醋酸纤维素薄膜电泳 （一） 血清γ-球蛋白的分离 与纯化 实验17 1．?掌握蛋白质分离纯化的主要方法和原理；2．熟悉盐析和层析的基本操作；3． 掌握离心机的正确使用方法。 【实验目的】 【仪器试剂】 试管、刻度吸管、吸耳球、胶头滴管、层析柱、反应板；血清、PBS液、葡聚糖凝胶G-25、纳氏试剂、双缩尿试剂、饱和硫酸铵溶液。 中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 沉淀蛋白质的方法还有哪些？ （2）盐析的影响因素 蛋白质的浓度 、盐浓度、 pH值、温度等。 本实验球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀而清蛋白溶解，γ-球蛋白在33%浓度的硫酸铵溶液中沉淀。 2.层析： 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。 3.检测分离效果 （1）纳氏试剂：盐存在时，NH4+ 与其反应呈现黄色或橙色。 （2）双缩尿试剂检测：蛋白质与其呈现红色或紫红色。 1．盐析 ⑴ 血清2ml放入离心管中，加入PBS2ml混匀逐滴加入饱和硫酸铵溶液2ml，边加边摇匀。静置10分钟后，离心3000 rpm 10分钟，倾上清液（上清中主要含清蛋白α、β球蛋白）。 【实验操作】 ⑵ 将离心管中的沉淀用1 ml PBS搅拌溶解，再逐滴加入饱和硫酸铵溶液0.5ml，边加边摇匀。静置10分钟后，离心3 000 rpm 10分钟 （注意离心机使用时需要配平并且离心时将盖子盖好）。倾上清液（上清中主要含清蛋白α、β球蛋白），沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白。 ⑴ 装柱：将制好的葡聚糖凝胶混匀，倾入层析柱内，静止后分层，凝胶高度要在柱高的1/3~3/4之间。当液面接近凝胶上表面时将出口胶管夹紧待用。 2.脱盐： 注意：装柱要均匀，不要有气泡和分层，凝胶面要平整 （2）加样： 向装有γ-球蛋白的离心管内加入PBS 10滴，用玻璃棒搅拌使之溶解。再用乳头吸管吸出γ-球蛋白液，加到层析柱内凝胶表面。待γ-球蛋白液全部进入凝胶柱内时，再用乳头吸管小心加入PBS约1cm高，待大部分液体进入凝胶柱后，再继续加PBS直至洗脱完毕（加液时注意不要冲击凝胶表面）。在整个洗脱过程中不能让液面降至凝胶面以下。 （3）收集： 加样同时可进行收集，每管收集1ml。收集12 管后加紧螺旋夹。回收凝胶和尼龙布等。 ⑷ 检测：准备反应板两块。将12管收集液各取1 滴分别放入反应板的12个凹孔。一块板的各孔内加纳氏试剂1滴，有NH4+ 者呈黄色至橙色。可用＋、－号表示有无呈色或颜色深浅。再向另一块板的各孔内加双缩脲试剂1滴，有蛋白者呈蓝紫色。 【实验结果】 可用＋、－号表示有无呈色或颜色深浅。将双色脲反应呈色最深的一管收集液保留供下次实验使用。利用醋酸纤维素薄膜电泳检测本次实验所提γ-球蛋白的纯度。 1．?使用离心机前注意配平； 2．?装柱要均匀，不要有气泡和分层，凝胶面要平整； 3．凝胶高度要在柱高的1/3~3/4之间； 4．脱盐时不能冲击凝胶面，PBS液面不能降到凝胶面以下； 5．实验后将凝胶中盐洗脱干净后回收再利用。 【实验注意事项】 【思考题】 1.装柱不均匀，凝胶面不平整对实验结果有什么影响？ 2. 盐析与变性的异同？ 3．凝胶层析的原理？ 透析与浓缩（Dialysis technique） 透析： 透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。 原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。 浓缩（Anti-dialysis） 浓缩将凝胶过滤得到的γ－球蛋白液倒入透析袋内，悬于盛有浓蔗糖溶液的小烧杯内，振荡1小时以上，观察袋内液体体积变化 （二） 血清γ-蛋白的鉴定 —— 醋酸纤维素薄膜电泳 实验8