Promocell原代细胞培养课件.ppt

解冻细胞——步骤 准备好装有培养基的细胞培养瓶 在CO2培养基中预热约30分钟 将冻存管从液氮罐中取出（总在干冰或者液氮中运输），开/关盖子 在37°C水浴中放置约90秒，解冻细胞 解冻细胞——步骤 准备好装有培养基的细胞培养瓶 在CO2培养基中预热约30分钟 将冻存管从液氮罐中取出（总在干冰或者液氮中运输），开/关盖子 在37°C水浴中放置约90秒，解冻细胞 消毒冻存管，将其中的细胞立即转移到预热的培养基中 解冻细胞——步骤 准备好装有培养基的细胞培养瓶 在CO2培养基中预热约30分钟 将冻存管从液氮罐中取出（总在干冰或者液氮中运输），开/关盖子 在37°C水浴中放置约90秒，解冻细胞 消毒冻存管，将其中的细胞立即转移到预热的培养基中 在CO2培养箱（37°C, 5% CO2）中放置大约16-24 h 细胞培养工程师 细胞 培养基 试剂 洁净层流罩 培养瓶/ 培养皿 塑料制品 CO2 培养箱 细胞培养中故障的其他原因 CO2 培养箱 参数： * 温度 * CO2 浓度 * 相对湿度 ?能维持细胞的生理条件 然而： * 这也是酵母菌，真菌和细菌的最佳生长环境！ * 频繁的开门会导致温度、CO2浓度和湿度的偏差 细胞培养工程师 细胞 培养基 试剂 洁净层流罩 培养瓶/ 培养皿 塑料制品 CO2 培养箱 细胞培养中故障的其他原因 更换培养基 培养基更换的频率和传代的间隔取决于特定细胞类型的生长速率 一般来说，原代细胞培养中的培养基需每2-4天更换一次： 周一– 周三– 周五 (快生长的细胞培养) 周一– 周四– 周一 (慢生长的细胞培养) 培养基更换太勤或太少都有消极的影响： 生长停滞 细胞死亡 用Melanocyte Growth Medium M2 培养的NHEM M2 (10x) 2天不换培养基 培养基更换太少时的细胞形态 1周不换培养基 2周不换培养基 培养基中的血清 血清是传统培养基配方中最不确定的成分！ 批次间差异极大（生长因子，激素，蛋白质） 建议： 对不同的批次进行预实验，购买并预留能在您的实验中发挥良好功能的批次（1-3年） 如果可能的话，使用血清含量较低或者无血清的培养基 如果没有必要，不要使用“热灭活”的血清 对血清加热 (30 min, 56°C) 的目的是为了灭活补体 保存和解冻： 保存：在4o C可以放置6-8周；-20o C 可保存3-5年 解冻：在室温或4oC冰箱中最理想，随放在37°C (水浴)。频繁地晃动以便分散释放出来的无机盐和蛋白质（避免局部盐浓度过高，避免血清温度过高） 避免血清的反复冻/融，以免产生沉淀 血清的使用会导致细胞形态不可逆的改变 气道上皮细胞生长培养基 (无血清) Bronchial Epithelial Cells (HBEpC, 10x) 在DMEM + 10%血清中培养2天 人类成骨细胞 50-60% 90-100% 贴壁的原代细胞必须在密度达到70-90%的时候传代 如果细胞长得太密会导致接触抑制、生长停滞 贴壁细胞的传代培养一般原则 预热脱壁试剂 贴壁细胞的传代过程 预热脱壁试剂 吸走贴壁细胞表面的生长培养基 贴壁细胞的传代过程 预热脱壁试剂 吸走贴壁细胞表面的生长培养基 在室温下，用PBS（不含Ca++/Mg++）和Hank’s BBS清洗细胞单层 贴壁细胞的传代过程 预热脱壁试剂 吸走贴壁细胞表面的生长培养基 在室温下，用PBS（不含Ca++/Mg++）和Hank’s BBS清洗细胞单层 吸走清洗溶液 贴壁细胞的传代过程 预热脱壁试剂 吸走贴壁细胞表面的生长培养基 在室温下，用PBS（不含Ca++/Mg++）和Hank’s BBS清洗细胞单层 吸走清洗溶液 加入胰酶/EDTA（0.04% / 0.03%） 贴壁细胞的传代过程 预热脱壁试剂 吸走贴壁细胞表面的生长培养基 在室温下，用PBS（不含Ca++/Mg++）和Hank’s BBS清洗细胞单层 吸走清洗溶液 加入胰酶/EDTA（0.04% / 0.03%） 在显微镜下观察脱壁过程（细胞形态逐渐变圆） 胰酶的浓度和的孵育作用时间取决于细胞的类型和细胞的生长密度 贴壁细胞的传代过程 用胰酶中止溶液或者含10%FCS的培养基中止胰酶的脱壁作用 贴壁细胞的传代过程 用胰酶中止溶液或者含10%FCS的培养基中止胰酶的脱壁作用 上下吹吸以重悬细胞，将上清液转移到一个离心管中 贴壁细胞的传代过程 用胰酶中止溶液或者含10%FCS的培养基中止胰酶的脱壁作用 上下吹吸以重悬细胞，将上清液转移到一个离心管中 在220g的重力加速度下离心3-5分钟 贴壁细胞的传代过程 用胰酶中止溶液或者含10