多重富集定量PCRME-qPCR同时检测4种食源性病原弧菌-兽类学报.PDF

中国农业科学 2016,49(23):4619-4627 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.23.014 多重富集定量PCR（ME-qPCR）同时检测4种食源性病原弧菌 1,2 3 4 1 1 1 2 魏 霜 ，汪天杰 ，龙 阳 ，周广彪 ，林春贵 ，黄 帅 ，吴希阳 1 2 3 （汕头出入境检验检疫局，广东汕头 515041 ； 暨南大学理工学院食品科学与工程系，广州 510632 ； 广州出入境检验检疫局，广州 510632 ； 4 湛江出入境检验检疫局，广东湛江 524022 ） 摘要：【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是 4 种重要的食源性病原弧菌，能够造成人类 多种疾病，建立同时检测这 4 种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶 藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量PCR（multiplex enrichment quantitative PCR，ME-qPCR） 方法，并含扩增内标用于指示 PCR 反应的假阴性，创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法，为这 4 种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S rRNA 为扩增内标靶序列设计引物，并针对副溶血弧 菌的 collagenase、溶藻弧菌的gyrB、霍乱弧菌的ompW、创伤弧菌的 vvhA，分别设计内、外2对特异性引物，首 先将所有内、外引物混合，进行一个循环数较少（10—20 cycles）的高通量多重富集PCR将靶基因富集出来，由 于循环数较少，各个基因得到均匀的扩增，每个基因均有 4 种可能的产物，每 1 种产物均能作为第二轮巢氏荧光 定量 PCR 的模板，这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率，然后将产物稀释后作为模板，利用内引物分别进 行巢式荧光定量PCR检测各个基因，最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集PCR 循环数（10、15 和 20 个循环），优化 ME-qPCR 第一轮循环数。采用 14 株标准菌株的基因组 DNA 作为模板，评价 ME-qPCR的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品（100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1 ） 作为模板，对建立的ME-qPCR 进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的 鉴定中，与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后，ME-qPCR 的第一轮循环数确定为15，特异性评价结 果显示该方法特异性强，灵敏度达0.001 ng，高于普通荧光定量PCR约 1个数量级，并能有效指示PCR反应的假 阴性，且拥有与普通荧光定量 PCR 相同的定量能力，扩增效率和 2 R 符合定量的要求；将建立的 ME-qPCR 方法应用 于 69 株疑似弧菌菌株的鉴定，24 个绿色菌落为副溶血弧菌，22 个黄色菌落为溶藻弧菌，1 个黄色菌落为创伤弧 菌，没有检出霍乱弧菌，其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、 溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这 4 种食源性病原弧菌，灵敏度高，并能有效指示 PCR 反应的假阴性，结果无需 凝胶电泳，适用于食品中4 种常见病原弧菌的快速筛检。 关键词：霍乱弧菌；创伤弧菌；副溶血弧菌；溶藻弧菌；扩增内标；多重富集定量PCR Multiplex Enrichment Quantitative PCR Assays for the Detection of Vibrio alginoly