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革胡子鲶抗菌肽hepcidin基因克隆和序列分析
革胡子鲶抗菌肽hepcidin基因克隆和序列分析
摘要 革胡子鲶生长快、抗病力强,是我国南方重要的水产养殖品种。应用逆转录和套式PCR方法从革胡子鲶(Clarias lazera)肝脏组织RNA中扩增出抗菌肽hepcidin基因cDNA片段,并克隆测序。序列全长233bp,该序列与另外6种淡水和海水鱼类的hepcidin序列进行了比较,序列同源性介于45.7%~76.6%之间,平均值为63.25%,说明克隆得到的hepcidin片断序列是正确的。这为研究革胡子鲶的抗病机理和hepcidin抗菌肽的开发利用提供了基础。
关键词 革胡子鲶;hepcidin;基因克隆
中图分类号 S965.1281.6 文献标识码A文章编号1007-5739(2008)11-0265-02
革胡子鲶(Clarias lazera)属鲶形目、胡鲶科、胡鲶属,是我国重要的淡水养殖品种之一,目前已在我国南方10多个省市普遍养殖。革胡子鲶病害少,抗病力强,对养殖水体条件要求不高,能在污水环境中长期养殖也不易发病并正常生长,耐低氧,食性独特,喜食其他动物内脏及腐烂的尸体,表现出极强的抗病特性。鱼类抗菌肽与其抗病能力密切相关,而hepcidin是种类繁多的抗菌肽中一种重要的免疫因子。本研究应用RT―PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,逆转录聚合酶链反应)技术得到了革胡子鲶体内的hepcidin基因cDNA片断,并测定其序列,为今后进一步探讨其免疫抗病机理以及通过基因工程方法合成hepcidin开发免疫制剂奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
试验鱼:革胡子鲶活鱼购自南宁市五里亭农贸市场。
宿主菌和质粒:大肠杆菌E.coli DH5a为广西大学遗传育种实验室保存。克隆质粒pMD18-T Vector购于宝生物(TaKaRa)大连生物工程有限公司。
酶和主要试剂:RNA PCR Kit(AMV) Ver 3.0试剂盒,Trizol试剂、质粒小量提取试剂盒、DNA胶回收纯化试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ均购自宝生物(TaKaRa)大连生物工程有限公司;其他试剂为国产分析纯。
引物:由上海鼎安生物科技有限公司合成。
1.2方法
引物设计:根据GenBank中鲶形目鱼类hepcidin基因的编码序列设计并合成2对特异性引物。外引物:上游F1: 5-AAGAAGCAGCAGAAGAAGGAGAACC和下游F2:5-TTAGAACCTGCAGCAGAACCCAC;内引物:上游F3:5-CGCGTGCGCCGTCATCGTCATC和下游F4:5-TCATT CAGCAGTTGCAGCAGAAT。
总RNA的提取:试验鱼运回实验室后处死,迅速从脑颅内取出脑垂体,立即用Trizol试剂提取总RNA,并电泳检测总RNA的完整性。
目的基因片断的RT-PCR:按RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0试剂盒说明的方法合成单链cDNA。然后以该单链cDNA为模板进行套式PCR。2次PCR反应条件相同,具体条件为:94℃预变性3min;94℃变性40s,63℃退火40s,72℃延伸45s,35个循环;72℃后延伸5min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳并观察结果。
目的基因片断克隆:将PCR产物与pMD18-T载体用T4 DNA连接酶进行连接反应,连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,涂布含有50mg/L的氨苄青霉素(AMP)LB平板培养。用BamH I、Sal I双酶切法和PCR法筛选鉴定阳性克隆。
序列测定:将经过阳性鉴定的菌液送上海鼎安生物科技有限公司进行测序。
序列分析:用DNAStar软件包的MegAlign程序进行序列的同源性分析。
2结果
2.1目的片断RT-PCR扩增和cDNA克隆
RT-PCR扩增结果如图1。通过2次PCR,最后得到长度为230bp左右的单一特异性片段。
目的片断经与pMD18-T载体连接后,成功转化到大肠杆菌DH5a。阳性克隆的重组子经双酶切鉴定,证明外源片段成功插入载体。此外,重组子经PCR鉴定,证明该质粒是含有外源目的片断的阳性重组子。
2.2目的基因片断序列测定
测定的革胡子鲶hepcidin片断序列见图2。序列全长233bp。其碱基组成为:A+T占45.49%,C+G占54.51%。
2.3同其他鱼类的hepcidin基因序列比较
将本研究得到的基因序列与其他6种鱼类的hepcidin基因序列进行碱基的同源性比较,统计得到了不同种类间的遗传
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