长链非编码RNA―HOTAIR和乳腺癌腋窝淋巴结转移相关性研究.docVIP

长链非编码RNA―HOTAIR和乳腺癌腋窝淋巴结转移相关性研究 　　【摘要】 目的：探索长链非编码RNA-HOTAIR在乳腺癌及前哨淋巴结、腋窝淋巴结中的表达情况，分析与乳腺癌其他指标的相关关系，以指导治疗并预测预后。方法：收集2013年6月-2013年12月乳腺癌住院手术患者10例，均行前哨淋巴结活检术，取乳腺肿块组织、癌旁组织及前哨淋巴结（SLN）、腋窝淋巴结（ALN）。术后均经病理证实为浸润性导管癌。四组标本组织采用实时荧光定量RT-PCR检测HOTAIR的表达情况，结合临床病理结果，采用t检验、等级相关等统计方法分析各指标之间的关系。结果：（1）HOTAIR基因在各组中的表达，SLN组（9.33±1.23），ALN组（6.90±2.00），两者比较差异有统计学意义（t=3.401，P=0.004）；癌组织组（8.81±1.27），癌旁组织组（7.00±1.11），两者比较差异有统计学意义（t=3.389，P=0.003）；SLN组与癌旁组织组比较差异有统计学意义（t=4.441，P0.001）。（2）HOTAIR表达情况与临床病理指标关系密切，与淋巴结转移率、ki-67蛋白表达呈正相关，相关系数分别为0.67和0.82，差异有统计学意义（P0.05）。结论：HOTAIR基因在乳腺癌前哨淋巴结以及癌组织中有异常高表达，其促进细胞增殖、侵袭转移的功能显著，提供乳腺癌基因靶向治疗的新位点。 　　【关键词】 长链非编码RNA； HOTAIR； 乳腺癌； 前哨淋巴结； 实时荧光定量 　　长链非编码RNA（large intervening non-coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，他们本身并不编码蛋白质，而常以RNA的形式调控基因的表达，包括表观遗传学调控，转录调控，转录后调控等[1-2]。最初研究认为lncRNA是RNA聚合酶Ⅱ的转录副产物[3]，然而近年来的研究提示其生物学功能广泛且参与多种重要的调控过程如染色质修饰、转录激活以及核内运输等等。HOTAIR是lncRNA的成员之一，与肿瘤发生发展关系密切[4-5]，其在乳腺癌中的研究限于对某些蛋白的表达调控[6]。本实验研究探索HOTAIR在乳腺癌组织及前哨淋巴结中的表达情况，为乳腺肿瘤的基因治疗提供新策略。结合临床病理资料分析，指导治疗及预测预后。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验对象入组标准及标本来源 　　1.1.1 实验对象入组标准 所有入组患者均签署知情同意书，实验研究符合伦理学原则。收集潍坊市人民医院乳腺外科2013年6-年12月住院患者，行乳房手术+前哨淋巴结活检术，术前穿刺病理诊断为乳腺浸润性癌，取乳腺癌组织、癌旁组织，癌旁组织选取乳腺非同一象限经病理证实为正常乳腺组织。前哨淋巴结（sentinel lymph node，SLN）探测仪结合亚甲蓝染料检出SLN≥2枚且术中冰冻病理示SLN有转移的患者入组，进而行常规腋窝淋巴结（Axillary lymph node，ALN）清扫。标本来源均为女性，年龄32～51岁，平均42.2岁。术后常规病理证实为浸润性导管癌，SLN转移数目不少于2枚，ALN转移率低于100%，获得SLN（+）组10例，ALN（-）组10例，乳腺癌组织组10例，癌旁组织组10例。记录患者年龄、前哨淋巴结（SLN）数目、腋窝淋巴结（ALN）数目、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、C-erbB-2、P53以及ki-67。淋巴结转移数分组采用N1、N2、N3（无N0患者）；淋巴结转移率（10%，10%～50%，50%）；ki-67表达（14%，14%～75%，75%）。 　　1.1.2 标本处理及保存 取前哨淋巴结，纵向等大剖开，一半冰冻检查，另一半RNAlater solution（购自AMBION公司）保存，留作提取RNA使用。冰冻检查示有癌组织转移，则另一半继续进行实验操作。腋窝淋巴结组取未转移淋巴结，剖开保存。癌组织、癌旁组织相同实验处理。所有标本均为新鲜标本，简单切碎组织样本，任何一边的最大厚度不超过0.5 cm，RNAlater液5倍于组织碎块并完全浸没，-80 ℃长期保存。入组病例临床病理资料见表1。 　　1.2 总RNA提取及质量判断 　　1.2.1 总RNA提取 异硫氰酸胍-苯酚（Trizol， 购自INVITROGEN公司）法提取总RNA：裂解细胞获得核酸，利用DNA和RNA在特定pH时溶解度不同，通过有机溶剂抽提沉淀RNA。-80 ℃冰箱保存组织样本室温下解冻，组织块放入处理好的EP管称重，一次提取的组织块重量在0.05～0.1 g之间，并做好记录。进行RNA提取，并防止DNA污染。 　　1.2.2 RNA质量判断 分光光度仪进行RNA定量，计算OD2