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PCR引物的设计及试题分析 　　PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难于对样品进行分析研究的问题，被广泛地应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。近年来，有关PCR引物的考查成为高考生物“基因工程”中的一个亮点，对学生思维的灵活性和临场答题的机敏性提出了更高的要求。下面拟通过介绍PCR引物设计的多个原则，望能拓宽学生解题的思路，迁移知识，灵活解题。 　　 一、 PCR引物的设计原则 　　PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 　　要设计引物，首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增片段的单链是否形成二级结构（DNA的二级结构是指两条脱氧多核苷酸链反向平行盘绕所形成的双螺旋结构）。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 　　然后在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30个碱基对，扩增片段长度为100~600个碱基对。 　　引物序列中（G+C）含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好是随机的。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则引物的设计就不合理，应重新寻找区域设计引物。 　　同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 　　引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 　　综上所述，可以归纳出十条PCR引物的设计原则： 　　①引物应用核酸系列保守区内设计，并具有特异性。 　　②扩增产物的单链不能形成二级结构。 　　③引物长度一般在15~30个碱基对之间。 　　④（G+C）含量在40%~60%之间。 　　⑤碱基要随机分布。 　　⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。 　　⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。 　　⑧引物5′端可以修饰。 　　⑨引物3′端不可修饰。 　　⑩引物3′端要避开密码子的第3位。 　　 例1 下图1为采用PCR技术从DNA分子中获取目的基因并扩增的部分过程。下图2为获得抗虫棉的技术流程，其中卡那霉素抗性基因（kan）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。请据图回答： 　　（1） PCR中用到的引物是一段已知脱氧核苷酸序列的DNA单链，为保证复制正常进行，引物必须符合的基本要求是除了与目的基因一端互补外，还必须具备_____________ 　　的特点。根据图1分析，至少经过______次循环复制过程，才可从DNA分子中分离出目的基因片段。 　　（2） A过程需要的酶为_______________ 　　_______________________。 　　（3） B过程及其结果体现了质粒作为载体必须具备的两个条件是________________ 　　____________________________________。 　　（4） 为促进土壤农杆菌对重组质粒的吸收，常用________________处理土壤农杆菌。 　　（5） C过程所用的培养基除含有必要营养物质、琼脂外，还必须加入__________，有利于愈伤组织形成。 　　（6） 若该转基因植株自交后代的具有卡那霉素抗性基因的植株比例为3／4，说明卡那霉素抗性基因已存在于该转基因植物细胞的________上。若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体培养，则获得的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占_______%。 　　 答案 （1） 相互之间不能互补 3 　　（2） 限制性核酸内切酶和DNA连接酶 　　（3） 具有标记基因；能在宿主细胞中复制并稳定保存 　　（4） Ca2+ 　　（5） 植物激素（或生长素和细胞分裂素） 　　（6） 染色体（或核DNA，只写DNA不得分） 100 　　创新一 以往关于PCR技术引物的问法常为：与体内DNA复制相比，PCR反应体系需加入__________种引物和_______________。答案为：2、耐高温的DNA聚合酶。需2种引物，学生往往是从DNA复制时两条母链均作模板来考虑。2种引物除分别与目的基因一端互补外，还必须具备__________的特点，学生就难于得出结论。试想2种引物如果本身相互之间