纯度测定的原理和方法 掌握离心机的使用方法.pptVIP

实验目的 学习从动物组织中提取DNA及其含量、纯度测定的原理和方法 掌握离心机的使用方法 兔肝脱氧核糖核酸（DNA）的提取和测定 在0.15M的氯化钠溶液中脱氧核糖核蛋白的溶解度最低。用0.15M氯化钠溶液洗涤可洗去其它物质。 沉淀用SDS处理，SDS使蛋白质与DNA解离，再用氯仿－异丙醇抽提，将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解。 DNA溶液用乙醇沉淀析出。 实验原理 实验操作 1. 弃上清留沉淀 兔肝 称取4 g 加 8ml 1X SSC 1X SSC洗 两次 取8ml匀浆液 离 心 匀浆、过滤 2.弃上清留沉淀 加至8ml 1X SSC 离 心 加至 8ml 0.15M NaCl-0.1M Na2EDTA 离 心 3.弃上清留沉淀 （脱氧核糖核蛋白） 加约2倍 体积 95% 乙醇 沉淀 加 0.15M NaCl-0.1M Na2EDTA至4ml 搅拌10min 逐滴加入0.5ml 15% SDS 加1ml 5M NaCl 去塞！离心 加塞反复 倒置抽提 10min 吸取上清液 勿吸到中间层！ 等体积氯仿-异丙醇混合液 DNA析出 用玻棒挑出 挑取DNA至一离 心管(小烧杯)用10ml 0.01N NaOH溶解 重复 一次 轻搅 10min 注意事项 尽可能避免DNA的断裂 1. 匀浆时应保持低温，且匀浆时间应短； 2. 实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管口应粗短并成钝口。 保持DNA活性，避免酸碱或其他变性因素使DNA变性。 搅动不要太大，以免使DNA断裂。 整个实验过程应在低温条件下进行。 搅拌时动作要轻，反复倒置抽提，不可激烈振荡。 加入15% SDS时要慢，边搅边滴加（两人配合）。 SDS的温度不能太低，易凝固。吸过SDS的吸管要及时清洗。 加入CHCl3/IAA液离心后，分为三层，由上到下为：无机相-蛋白相-有机相。DNA溶解在无机相中，吸取无机相时动作要轻，不要吸到蛋白相。 CHCl3/IAA会溶解有机玻璃，用完后不能竖直放置在试管架上，必须冲洗干净。 离心机的使用 打开电源开关； 平衡放置离心管；盖上盖子。 调节时间旋钮至10min； 缓慢调节速度旋钮至9档，每5-10s上升1档； 离心完毕后机器自动停止，待完全停止后，打开盖子取出离心管。 离心管必须平衡后，才能启动离心机； 离心机的盖子必须盖紧； 离心过程中不要用重物撞击离心机； 要等离心机完全停止转动后再打开盖子。 二苯胺显色法测定DNA含量 DNA的α-脱氧核糖在酸性条件下转变成ω-羟基-r酮基戊醛，与二苯胺共热后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处最大吸收。每ml含20－400μg范围内光密度与DNA的浓度成正比。用标准曲线法测定DNA含量。 用生物分光光度计（用紫外光度法）分析DNA含量与纯度 实验原理 取8支试管，按实验指导的表格加入试剂。 加毕置沸水浴10分钟，取出冷却；以0号管（空白管）调零点，于595nm波长比色。 以光密度为纵坐标，DNA含量（μg/ml）为横坐标，绘制标准曲线. 将实验中所得到的兔肝DNA溶液作为待测样品，取两只试管，分别标“U”和“B”，按表加入试剂。 混匀，置沸水中10min, 取出冷却。 在595nm处，以B管调零，测得待测液的光密度值，从标准曲线上查出相当于该光密度值DNA的含量。 实验操作 核酸在220-320nm处呈特征性吸收，在260nm处有最大吸收，测A260/A280可得知核酸的大致纯度。 A260/A280 ≈1.8 表示DNA纯 1.8 RNA含量高 1.8 蛋白含量高 核酸紫外吸收的测定 以0.01N NaOH 为空白管，调零，按“blank”。样品池中加入样品，按“sample”，记录样品液的A260/A280比值和DNA浓度。 实验操作 * 實驗 P1 * 實驗 P1