2014年山西运城临床患者乙型脑炎病毒E分子生物学特征及基因分型的研究.docVIP

2014年山西运城临床患者乙型脑炎病毒E分子生物学特征及基因分型的研究 　　【摘要】 目的 初步了解2014年山西省运城地区病毒性脑炎患者中乙型脑炎病毒E基因分子生物学特征和基因型别分布特征。方法 采集19例临床诊断为病毒性脑炎患者的脑脊液标本， 提取核酸通过巢式聚合酶链式反应（nPCR）扩增乙型脑炎病毒基因片断， 采用生物信息学软件对病毒E基因区段核苷酸和氨基酸序列进行分子生物学特征分析并与通过构建系统进化树与国内外不同年代和地域分离的覆盖5个基因型别的乙型脑炎病毒进行基因型别研究。结果 19例山西运城脑炎患者标本中有2例为乙型脑炎病毒核酸阳性， 基因分型结果显示均为基因Ⅰ型乙型脑炎病毒。结论 2014年山西运城地区病毒性脑炎患者中乙型脑炎病毒为基因Ⅰ型， 与毒力相关的8个位点与乙型脑炎病毒P3一致， 没有发生突变， 不会影响病毒毒力。理论上表明， 目前使用的乙型脑炎病毒疫苗对当地的乙型脑炎病毒仍具有保护力。 　　【关键词】 虫媒病毒；乙型脑炎病毒；序列分析；种系发生 　　DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.24.017 　　流行性乙型脑炎又称为日本脑炎（JE）， 是由携带乙型脑炎病毒的节肢动物通过叮咬人畜传播造成的传染性疾病。乙型脑炎首次于1924年在日本报道， 此后相继在亚洲以及南太平洋地区传播流行。近年来乙型脑炎不断发生爆发式流行， 我国最近的一次乙型脑炎病毒大流行发生在2006年[1]， 山西运城地区发生乙型脑炎80余例， 死亡20余人。乙型脑炎已经成为引起全世界关注的重要的公共卫生问题。 　　乙型脑炎的病原体为乙型脑炎病毒（JEV）， 属于黄病毒科， 黄病毒属。基因组为11 kb的单股正链RNA， 可编码3个结构蛋白：C、M、E， 与病毒致病性和免疫原性重要相关。编码7个非结构蛋白：NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5。根据基因组中编码E蛋白的核苷酸的差异， 将乙型脑炎分为5个基因型， 分别为基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型。乙型脑炎是一种疫苗可预防性疾病， 我国目前使用的乙型脑炎疫苗株P3株和Sa14-14-2株， 此两株病毒株均为基因Ⅲ型乙型脑炎毒株。根据最新的乙型脑炎病毒分子流行病学研究结果显示[2， 3]， 目前流行的乙型脑炎病毒优势基因型别已经发生了转化， 由基因Ⅲ型转化为基因Ⅰ型[4， 5]。有文献报道， 临床出现接种乙型脑炎疫苗后仍感染乙型脑炎病毒的病例， 经分子基因特征分析为基因Ⅰ型乙型脑炎病毒感染[6]。因此， 开展运城地区乙型脑炎病毒基因分型和分子特征研究对于明确运城地区流行的乙型脑炎病毒基因型别， 了解运城乙型脑炎病毒的分子进化特征， 评估目前使用的乙型脑炎病毒疫苗的免疫保护力的研究具有重要意义。现报告如下。 　　1 材料与方法 　　1. 1 标本来源 2014年6～10月， 收集到运城市中心医院临床诊断为病毒性脑炎患者的脑脊液标本19份。 　　1. 2 RNA提取及逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR） 采用QIAamp Viral RNA Mini Kit（美国QIAGEN公司） 提取患者脑脊液标本中病毒的总RNA， 采用Amersham Bioscience Ready-to-GoTM You First-Strand Beads （美国Amersham Pharmacia Biotech）制备cDNA。取2 μl cDNA做反应模板， 采用巢样PCR方法进行乙型脑炎病毒特异性核酸检测， 引物如下： PEf：ACGTTCTTCAAGTTTACAGCA； PEr：GGAAATGAAGGCTCAATCATGTG；PEfn：GATGTCAATGGC 　　ACATCCAGT； PErn：CGTTCTTCAAGTTTACAGCATTAGC。先依次加入10×Buffer 5 μl、2.5 mmol/L dNTP 5 μl、上下游引物各1 μl、exTaq酶0.75 μl、去离子31.75 μl， 充分混匀， 94℃预变性5 min， 94℃30 sec， 55℃30 sec， 72℃1.5 min， 30个循环， 72℃延伸10 min， 1%琼脂糖电泳检查扩增条带， 用TaKaRa DNA fragment Purification Kit纯化PCR扩增产物， 送上海生工生物公司测序。 　　1. 3 病毒序列分析 本次实验从GenBank中选取覆盖全部5个基因型别的49株乙型脑炎病毒的E基因序列为对照进行序列及进化分析。采用Clustal X（1.83）软件进行序列联配分析， BioEdit软件进行序列编辑， 采用DNASTAR软件进行核苷酸及氨基酸差异度分析， MEGA6完成病毒进化分析， 氨基酸位点对比分析由GENEDOC