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亲水性相互的作用色谱四极杆串联线性离子阱质谱测定蛋白食品中L羟脯氨酸残留 　　摘 要 建立了亲水性相互作用色谱-四极杆串联线性离子阱质谱检测含蛋白食品中的皮革水解蛋白标示物L-羟脯氨酸（L-HYP）的同时定性与定量分析方法。样品中的L-HYP经酶解后用乙腈沉淀蛋白，HLB小柱除去部分脂溶性干扰物，采用液相色谱-质谱进行测定。本方法采用IDA结合EPI模式对试样中的L-HYP进行定性分析，并建立L-HYP的二级子离子谱库。通过以MRM模式对L-HYP进行定量分析，L-HYP在12种蛋白食品中平均回收率在73.4%～114.2%（n＝6）之间，相对标准偏差在2.5%～14.4%（n＝6）之间，可对试样中的L-HYP在定性确证的同时进行定量分析。 　　关键词 L-羟脯氨酸；亲水性相互作用色谱；四极杆串联线性离子阱质谱；皮革水解蛋白 　　 　　1 引 言?? 　　皮革水解蛋白是利用皮革、皮鞋下脚料及动物毛发，经水解提炼而生成的一种蛋白。由于水解过程中添加重铬酸钾和重铬酸钠等重金属盐，具有潜在的致癌和致畸作用，早在2009年就被列入我国“第二批食品中可能违法添加的非食用物质名单”。不法商贩将皮革水解蛋白添加到乳与含乳食品中，以提高食品的表观蛋白质含量，对相关食品制造行业和消费者身体健康造成的严重威胁。?? 　　L-羟脯氨酸（L-hydroxyproline，L-HYP，结构式如表1）是组成动物胶原蛋白的特征性氨基酸。检测皮革水解蛋白多以L-HYP为标示检测物，其检测方法主要有比色法、毛细管电泳法、氨基酸分析仪、液相色谱法及液相色谱/质谱法等。已有液相色谱-串联四极杆质谱测定L-HYP的报道均为采用选择离子方式检测，方法灵敏度较低；由于羟脯氨酸极性强，采用反相色谱分离时需要进行衍生，方法繁琐，并且不能完全进行确证；此外，采用反相色谱分离需用离子对试剂增加L-HYP的保留性，因此色谱和质谱的兼容性较差，无法满足大量样品同时检测的需求。本研究采用亲水性相互作用色谱-四极杆串联线性离子阱质谱对含蛋白食品中的L-HYP进行定性与定量测定。亲水性相互作用色谱能够较好地分离多种氨基酸类，方法简便，无需衍生，灵敏度高，同时由于使用高比例的有机相，与质谱具有良好的兼容性，方法的灵敏度较高；可以满足日常检测中大量试样同时检测的需求。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂?? 　　API 4000 Q-TRAP 四极杆串联线性离子阱质谱仪（美国AB 公司）； SHISEDO Nano Space高效液相色谱仪（日本资生堂公司）； Allegra X-22R 高速离心机（美国Beckman 公司）； 固相萃取装置（美国Suplco 公司）。0.22 　　 m有机相滤膜（德国CNW 公司）。HLB固相萃取小柱（200 mg，3 mL，美国Waters 公司）。?? 　　L-羟脯氨酸（L-Hydroxyproline）， L-茶氨酸（L-Theanine）， L-亮氨酸（L-Leucine）， L-异亮氨酸（L-Isoleucine）和L-精氨酸（L-Arginine）的标准品（纯度均大于99%， 美国Sigma公司）。牛胰蛋白酶14043 U/mg，猪胰蛋白酶14670 U/mg（美国Sigma 公司）； 乙腈、甲醇（ HPLC 纯，J . T. Baker 公司）； 甲酸（ ACS 纯，J. T. Baker 公司）及甲酸铵（HPLC纯，德国CNW公司），实验用水为超纯水（Millipore系统生产）。 　　2.2 标准储备液及标准工作溶液的配制?? 　　分别称取0.0100 g标准品，用纯水溶解，乙腈稀释并定容至10 mL，配制成10 g/L标准储备液，于4 ℃冰箱内避光保存，有效期为12个月。?? 　　吸取适量标准工作溶液，用基质空白溶液配制成适当浓度的混合标准工作溶液，临用时现配。 　　2.3 样品前处理?? 　　称取均质固态试样（奶油、饼干、奶糖、奶粉、奶酪、巧克力）1 g，或者液态试样（液态奶、炼奶、冰淇凌）2 g（精确至 0.01 g），置于 50 mL塑料离心管中，加入适量 L-茶氨酸标准溶液，5 mL 100 mmol/L甲酸铵缓冲盐溶液，50 　　 L蛋白酶液，漩涡混合2 min，50 ℃下酶解3 h后，加入5 mL乙腈，涡旋振荡2 min，以10000 r/min 离心5 min。HLB小柱用3 mL甲醇、3 mL水活化，巧克力试样过HLB小柱后直接收集样液，所有试样取样液，过0.22 　　 m滤膜，供LC-MS/MS测定。 　　 　　 　　分 析 化 学第39卷 　　第9期赵善贞等： 亲水性相互作用色谱-四极杆串联线性离子阱质谱测定蛋白食品中L-羟脯氨酸残留 　　 　　2.4 色谱/质