华佗再造浸膏对大鼠局灶性脑缺血再灌注神经发生的作用及机制的研究.docVIP

华佗再造浸膏对大鼠局灶性脑缺血再灌注神经发生的作用及机制的研究 　　[摘要] 目的：观察华佗再造浸膏（Huatuo Zaizao extractum，HTZZ）对栓线法阻断大脑中动脉（middle cerebral artery occlusion，MCAO） 致大鼠局灶性脑缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R ）神经发生（neurogenesis）的作用及其机制。方法：健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠55只，随机分为假手术组，MCAO模型组，HTZZ高、中、低剂量组（5，2.5，1.25 g·kg-1）。每组11 只，灌胃给药，MCAO手术当天开始连续给药7 d，每日1次。采用栓线法阻断大脑中动脉，建立大鼠局灶性I/R模型。缺血90 min，再灌注7 d后，免疫荧光染色观察缺血侧神经发生，蛋白免疫印记法检测细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和cAMP效应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）表达。酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定血管内皮生长因子（vascular endothelial growth facto，VEGF）和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）水平。结果：90 min MCAO/7 d再灌注半暗带皮层新生神经元 （BrdU+-NeuN+）数量增加。伴随这一变化，损伤侧皮层ERK和CREB磷酸化表达升高，VEGF和BDNF水平升高。HTZZ可促进缺血侧新生成熟神经元 （BrdU+-MAP-2+） 产生，促进ERK 和CREB磷酸化，提高VEGF和BDNF水平。结论：HTZZ可促进神经发生，可能是有效中药华佗再造丸促进缺血脑区自修复功能的干预靶点。 　　[关键词] 华佗再造浸膏；大脑中动脉栓塞；缺血/再灌注；神经发生；细胞外信号调节激酶 　　[收稿日期] 2013-07-03 　　[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项（2011ZX09201-201-09）；国家自然科学基金项目 　　[通信作者] *刘建勋，Tel：（010E-mail：liujx0324 @ 　　神经干细胞（neural stem cell，NSC）在一定条件下可增殖分化成神经元和胶质细胞，参与神经功能的修复过程，称为神经发生（neurogenesis）。研究证实，脑缺血后神经发生是脑损伤自我修复的重要机制[1-2]。脑缺血可以激活自体的神经干细胞增殖、迁移、分化，诱导损伤区域内神经发生向神经元方向分化并在神经组织内整合。因而，采用干预手段，创造中枢神经系统（central nervous system，CNS）中受损神经元生存的合适环境，激活自身的NSC 和内源性修复机制，增加自体的神经发生，在早期血管性痴呆防治中具有重要意义[3-4]。目前有关中药通过促进神经发生对急性脑缺血/再灌注损伤后缺血半暗带修复的作用及机制报道较少。 　　华佗再造丸（Huatuo Zaizao pill，HTZZ ）是广州白云山奇星药业有限公司生产的用于治疗和预防心、脑血管疾病及其后遗症中风瘫痪的纯中药制剂，对中风及其后遗症、冠心病心绞痛、脑血管硬化、老年期痴呆等疾病具有治疗作用[5]。本团队最近亦报道HTZZ可有效恢复脑缺血再灌注造成的脑微血管内皮水肿和血脑屏障超微结构损伤，改变功能性（膜偶联）G蛋白偶联受体亚细胞分布，并抑制基质金属蛋白酶表达[6]。本研究拟采用栓线法阻断大脑中动脉（middle cerebral artery occlusion，MCAO） 致大鼠局灶性脑缺血/再灌注（ischemia /reperfusion，I/R）模型，进一步从恢复神经发生角度探讨了HTZZ治疗局灶性缺血再灌注损伤、改善记忆的可能机制，为临床应用提供理论依据。 　　1 材料 　　1.1 药物与试剂 HTZZ浸膏，广州奇星药业有限公司，每克相当于2.41克生药。BrdU和HRP标记的山羊抗兔IgG购自Sigma公司；小鼠抗BrdU抗体购自Santa Cruz公司；兔抗磷酸化和非磷酸化细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和cAMP效应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB） CREB多克隆抗体购自 Sigma-Aldrich公司。FITC和Cy3标记抗鼠和兔IgG为Beyotime公司产品