发酵液中苏氨酸含量测定的方法的研究.docVIP

发酵液中苏氨酸含量测定的方法的研究 　　摘要 L-苏氨酸是一种必需的氨基酸,主要用于医药、化学试剂、食品、饲料添加剂等方面。目前,L-苏氨酸含量测定方法有氨基酸分析仪法、纸层析法、茚三酮法和甲醛法。本文对上述几种测量方法的原理和方法进行介绍,并比较了各种方法的优缺点。 　　关键词 L-苏氨酸;纸层析;茚三酮;甲醛法 　　中图分类号O6 文献标识码A 文章编号 1674-6708(2010)25-0115-02 　　 　　1 L-苏氨酸的理化性质 　　L-苏氨酸(Threonine)化学名称是α―氨基―β―羟基丁酸,分子式为NH2―CH(C00H)―CHOH―CH3,分子量为119.12,外观为白色斜方晶系晶体或结晶性粉末、无臭、味微甜,约256℃熔化分解。易溶于水,不溶于乙醇、乙醚和氯仿。 　　2 L-苏氨酸的应用 　　L-苏氨酸是一种必需的氨基酸,苏氨酸主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。特别是饲料添加剂方面的用量增长快速,它常添加到未成年仔猪和家禽的饲料中,因此,在欧盟国家和美洲国家,已广泛地应用于饲料行业。 　　3 L-苏氨酸的生产及检测方法 　　苏氨酸的生产方法主要有发酵法,蛋白质水解法和化学合成法3种,微生物发酵法生产苏氨酸,因其工艺简单,成本低廉等优点已成为目前主流方法。发酵中间过程中苏氨酸含量的测定方法有多种,主要有氨基酸分析仪法、茚三酮法、纸层析法、甲醛滴定法等。 　　3.1氨基酸分析仪法 　　3.1.1原理 　　氨基酸分析仪中的阳离子交换柱,利用氨基酸的pKa值的不同,用柠檬酸缓冲液不同的pH的变化使氨基酸被逐一淋洗下来;经处理后的苏氨酸发酵液经离子交换树脂吸附、分离,并以茚三酮作柱后衍生反应测定。 　　3.1.2分析步骤 　　精确量取取适量苏氨酸发酵液和L-苏氨酸标准溶液,用0.22micro;m微过滤膜过滤。按照氨基酸分析仪检测步骤上机测定。测定之前须将样品按照苏氨酸浓度进行合理稀释,以符合氨基酸分析仪的浓度要求。 　　3.2纸层析法 　　3.2.1原理 　　纸层析法是以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分,流动相为不与水相溶的有机溶剂。将试样点在纸条的一端,然后用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后,由于各组分移动距离不同,最后形成互相分离的斑点。将纸取出,待溶剂挥发后,用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离与已知样比较,进行定性、定量分析。用斑点扫描仪或将组分点取下,以溶剂溶出组分,用适宜方法定量。 　　3.2.2分析步骤 　　点样:准确吸取一定量浓度样液,点于准备好的层析纸的点样标记处,预留两点作空白。展开:放入有展开剂的层析缸中,上行展开,1.5h后取出。烘干显色:置90℃烘箱中干燥5min,均匀地涂上显色剂, 90℃烘箱中再干燥5min,主斑应呈紫红色。 　　洗脱及测定:将烘干的纸层上苏氨酸斑剪下同样大小的纸条,加入洗脱剂,浸泡洗脱至滤纸条上斑点颜色全部消去为止,静置后在511nm处,以洗脱剂作为空白,测定空白样及待测样吸光度。同时制苏氨酸标准曲线,与样品测定同步进行。将测得的样品吸光值带入标准曲线方程,求出相应含量。 　　3.3 茚三酮曲线法 　　3.3.1原理 　　利用苏氨酸与茚三酮溶液专一呈色反应进行比色定量测定。茚三酮和游离氨基酸在酸性条件下进行反应,氨基酸被氧化分解成醛、NH3 和CO2;水合茚三酮被还原,还原型茚三酮又与NH3和另一分子茚三酮进一步缩合生成紫红色化合物。 　　3.3.2 操作步骤 　　分别吸取1.0ml含L-苏氨酸为20mg/dl、25mg/dl、30mg/dl、35mg/dl于每个试管中,分别再加入2.0ml柠檬酸缓冲液和1.0ml茚三酮显色液,摇匀后用铝箔封好试管口,放在100℃沸水浴中煮10min,用自来水冷却至室温,再分别加入10ml蒸馏水摇匀。 　　在波长为530nm的722S型分光光度计测吸光值,以浓度值为横座标,吸光值为纵座标绘出标准苏氨酸曲线图。发酵液样品稀释适量倍数后,与标准同时测定,通过标准曲线得出苏氨酸含量。 　　3.4甲醛滴定法 　　3.4.1原理 　　L-苏氨酸是两性电解质,在水溶液中有如下平衡: 　　常温下,甲醛能迅速与苏氨酸的氨基结合,生成羟甲基化合物,使上述平衡右移,促使-NH3释放H+,使溶液的酸度增加,在PH9.2时H+完全释放,因此,可用标准氢氧化钠溶液滴定,计算出氨基氮的含量。 　　3.4.2 分析步骤 　　氨基酸氮的测定:吸取2.0mL样品,置于200mL烧杯中,加水78mL,开动磁力搅拌器,用氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=0.1mol/L]滴定至酸度计指示pH=8.2。加入10.0mL甲醛溶液,混匀。再用氢氧