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安徽乌菜游离小孢子培养及植株再生的体系建立 　　摘 要：以6份安徽乌菜为试材，研究基因型、6-BA、AG对乌菜小孢子胚状体发生的影响及6-BA对植株再生的影响。试验结果表明，不同基因型乌菜的小孢子胚诱导率具有明显差异，6份乌菜材料中有3份诱导出胚状体，H-4出胚率最高，平均每花蕾诱导8.76个胚；NLN-13培养基中添加0.2 mg/L 6-BA和AG 10 mg/L均能促进胚状体发生，后者促进作用更明显；MS培养基中添加1 mg/L 6-BA可提高乌菜胚状体成苗率。 　　关键词：乌菜；小孢子培养；诱导率；胚状体；植株再生 　　中图分类号：S634.4 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2017）06-0029-04 　　安徽乌菜是安徽省名优特产，是十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种，杂种优势明显，常规杂交法育种年限较长，结合现代生物技术进行乌菜育种对提高育种水平和效率至关重要。 　　游离小孢子培养是育种中最有效的生物技术之一，在大白菜、不结球白菜、菜薹等十字花科蔬菜作物上多有报道[1～4]，而对于乌菜的小孢子培养研究较少，存在胚状体诱导率低的问题。本试验选用6份不同基因型的安徽乌菜为试材，进行游离小孢子培养，探讨6-BA（6-苄氨基嘌呤）和AG（阿拉伯半乳聚糖）对乌菜游离小孢子培养胚状体诱导率的影响及6-BA对胚状体植株再生的影响，为建立优化乌菜游离小孢子培养技术体系提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 ?验材料 　　选用安徽地方乌菜材料6份，材料编号1403、1404、1408、1416、1418、H-4。 　　试验材料于2015年9月6日播种，10月4日定植，露地栽培，常规管理。2015年12月，每份材料选取10株移植到塑料大棚。2016年3～4月初花期至盛花期选取适宜大小的花蕾进行游离小孢子培养。 　　1.2 试验方法 　　①胚诱导培养 小孢子培养基本操作流程参照申书兴等[5]大白菜游离小孢子培养方法。在初花期至盛花期，于晴天8：00～10：00，选取健壮、大小适宜的花蕾（花瓣与花药长度比例1∶2～3∶4，多数小孢子处于单核靠边期），以主枝和一级侧枝上的花蕾为宜。放入25 mL无菌小烧杯中，首先用70%酒精消毒30 s，其次用2.5% NaClO溶液消毒5 min，然后用无菌水冲洗3次；加入B5无菌液体培养基，用玻璃棒轻轻挤压使小孢子游离出来，经350目滤网过滤，收集滤液于15 mL旋盖离心管中，于1 000 r/min离心3 min，弃上清，重复2次，得游离纯化的小 　　孢子。 　　将分离纯化后的小孢子分别附加0、0.2、 　　0.4 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）或0、5、10、20 mg/L阿拉伯半乳聚糖（AG）的 NLN-13 培养基制成悬浮液，添加活性炭0.1 mg/mL，调整小孢子密度约1×105个/L，分装于直径60 mm的无菌培养皿中，以Parafilm膜封口，每份材料取花蕾25个，分装于4 皿培养，重复 3 次。33℃黑暗热激培养24 h后，转入25℃黑暗条件下培养，有肉眼可见的胚出现时，转移到转速60 r/min的摇床上继续暗培养至形成子叶型胚状体，3周后统计胚状体数目。②胚状体植株再生 利用附加浓度为0、1 mg/L 6-BA，10 g/L琼脂，30 g/L蔗糖的MS固体无菌培养基作为胚状体成苗培养基，将获得的乌菜成熟胚状体转接入成苗培养基中，3周后统计成苗率。 　　2 结果与分析 　　2.1 供体基因型的影响 　　在6份乌菜材料游离小孢子培养中，有3份诱导出胚状体（H-4、1404、1408），占参试材料的50%。 　　其中H-4产胚能力较强，在添加10 mg/L AG的 NLN-13培养基中，平均每花蕾可诱导8.76个胚；1408次之，平均每花蕾可诱导2.91个胚；1404平均每花蕾可诱导1.16个胚。而1403、1416、1418则没有胚状体产生。可见，不同基因型乌菜材料的小孢子培养胚状体诱导率存在差异。 　　2.2 6-BA对乌菜小孢子胚状体诱导的影响 　　在NLN-13诱导培养基中加入不同浓度的6-BA，胚状体诱导率统计结果见图1。对于能诱导出胚的3份材料，6-BA浓度对胚状体诱导率的影响均呈单峰变化，低浓度的6-BA对乌菜小孢子胚诱导有一定的促进作用。当6-BA浓度为0.2 mg/L时，胚诱导率达到最高，乌菜1404、1408、H-4平均每花蕾诱导胚状体数目依次为3.64、1.16、0.68个。 　　2.3 AG对胚状体诱导的影响 　　在NLN-13诱导培养基中加入不同浓度AG，25℃暗培养20 d，统计结果表明（图2），低浓度的AG对乌菜小孢子胚诱导有一定的促进作用，高浓度的AG则有抑制作用。当AG浓度为10 mg/