多肽作为识别元件及在其免疫分析伏马菌素B1中的应用-营养与食品卫生学专业论文.docxVIP

摘要 摘要 万方数据 万方数据 摘 要 伏马菌素 B1（Fumonisin B1，FB1）主要是由串珠镰刀菌、层生镰刀菌等镰 刀菌属产生的水溶性次级代谢产物，主要污染玉米，小麦及其他谷物，也是伏 马菌素（Fumonisins）家族中毒性最强的，能够导致马脑白质软化症，猪肺水肿， 人的原发性肝癌，食道癌等。真菌毒素检测是保障食品安全的重要环节，为了 精确定量真菌毒素，各种检测方法已经建立，如气相色谱法，高效液相色谱法， 酶联免疫分析等。其中免疫学检测是基于抗原抗体特异性结合的免疫分析技术， 具有简便快速、廉价和便于高通量筛选等优点。包括真菌毒素在内的小分子因 其分子量，表位单一，不能同时结合两个抗体，因此免疫检测小分子主要是竞 争模式，其需要将小分子与载体蛋白（BSA，OVA 等）偶联制备检测抗原或者 与标记分子偶联制备竞争抗原。这个过程需要专业的操作人员，及复杂的分离 纯化过程，特别是有机溶剂的引入易造成对操作人员伤害和环境污染。 本实验以 FB1 为研究对象，采用噬菌体随机十二肽库，以 FB1 单克隆抗体 3F11 为靶分子，应用生物淘选及分子克隆技术，生物合成了异源性 FB1 检测抗 原。基于生物合成的 FB1 检测抗原，建立了玉米中 FB1 的酶联免疫检测方法。 其次，分别以抗 FB1 单克隆抗体和多克隆抗体与 FB1 形成的复合物为靶分子， 采用负筛选的方法，淘选噬菌体随机十二肽库，为筛选抗小分子抗原抗体复合 物多肽，建立非竞争免疫检测小分子提供参考，主要研究结果如下： 1.采用噬菌体淘选技术，获得了 7 种能特异性竞争结合 3F11 的模拟表位， 分别命名为 F1，F3，F4，F7，F15，F17，F22。采用间接竞争 Phage-ELISA， 建立了基于 F1，F3，F4，F7，F15，F17，F22 的标准曲线，IC50 分别为 0.422 ±0.021 ng/mL，0.534±0.024 ng/mL，0.464±0.031 ng/mL，0.351±0.023 ng/mL， 0.875±0.059 ng/mL，0.405±0.022 ng/mL，0.312±0.025 ng/mL。以 F1 为研究对 象，建立了基于噬菌体展示 FB1 模拟表位 PVDF 膜基质法检测 FB1，检测阈值 为 2.5 ng/mL，可裸眼直接判断结果。 2.采用 PCR 技术，克隆了 7 种 FB1 模拟表位，成功构建了 pMAL-F1-MBP， pMAL-F3-MBP ， pMAL-F4-MBP ， pMAL-F7-MBP ， pMAL-F15-MBP ， pMAL-F17-MBP，pMAL-F22-MBP 7 个原核表达载体，转化至 TB1 中，经 0.3mM II IPTG 诱导表达，获得了生物合成 FB1 检测抗原：F1-MBP，F3-MBP，F4-MBP， F7-MBP，F15-MBP，F17-MBP，F22-MBP。经间接竞争 ELISA 分析，结果显示 只有 F1-MBP ， F15-MBP 能与 FB1 竞争 结合 3F11 ， IC50 分别 为 2.15 ± 0.13ng/mL，1.26±0.08 ng/mL。 3.以生物合成的 FB1 检测抗原 F1-MBP 为研究对象，对比分析了 pH，盐 离子强度，甲醇浓度以及热处理对 F1-MBP 和人工抗原 FB1-BSA 免疫学性能 影响，结果显示两者免疫学性能基本无差异。建立了基于 F1-MBP 的间接竞争 ELISA 标准曲线和 IC50 为 2.15±0.13 ng/mL，与 FB1-BSA（IC50 为 21.39± 1.15）相比，灵敏度提高了约 10 倍。同时建立了基于 F1-MBP 膜基质检测 FB1， 检测阈值为 2.5 ng/mL，与 FB1-BSA 相比灵敏度提高了 10 倍。分别用以上两 种方法和传统的商业化 ELISA 试剂盒检测 30 份玉米样品，结果显示两者之间 无显著差异，相关性良好（R2=0.98）。 4.采用噬菌体随机十二肽库，分别以抗 FB1 单克隆抗体与多克隆抗体和 FB1 形成的复合为靶分子，利用负筛选的方法，经过三轮筛选，获得了 23 个阳 性克隆，经测序发现 23 个阳性克隆都有多个插入片段。 关键词：伏马菌素 B1；多肽；模拟表位；非竞争免疫分析；异源分析 III Abst Abstract ABSTRACT Fumonisin B1, a water-soluble secondary fungi metabolite, is mainly produced by Fusarium moniliforme, Fusarium proliferatum and especially