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苍蝇抗菌肽 SK84的表达纯化及其结构和功能的初步研究-生物化学与分子生物学专业论文
独创性声明
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学位论文作者签名: 指导教师签名:
日期: 年 月 日 日期: 年 月 日
华
华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文
I
I
摘 要
抗菌肽是生物体自身产生的具有抑杀微生物效果的活性肽,两亲性的 α 螺旋结 构为其发挥抗菌作用提供了重要基础。与抗生素相比,抗菌肽抗菌谱广、不易引发 耐药性,因而有望被开发为抗微生物感染的新型药物。
SK84 是陆婕博士于 2006 年从蝇蛆中鉴定的一种新型抗菌肽,研究发现,SK84 能裂解细胞膜,对部分革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、金黄色葡 萄球菌等有杀伤作用,并且能够抑制肝癌细胞 HepG2、乳腺癌细胞 MCF-7 和 MDA-MB-231 等的增殖。
SK84 在天然产物中含量很少,分离纯化困难,而化学合成成本较高,因而限制 了对其功能与作用机制的研究。本课题建立了一种新的 SK84 生产方法,并对获得 的蛋白进行了功能和结构的初步研究,主要结果如下:
1) 构建了重组质粒 pET-32a(+)-SK84-His6,并在大肠杆菌中获得成功表达。
2) 优化了诱导表达条件,最佳条件为:初始菌液 OD 值,1.0;IPTG 浓度,1.0mM; 温度,30℃;诱导时间,4h。
3) 活性研究发现,表达的 SK84 对枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌有一定的抑 制作用,并促进 HepG2 细胞的凋亡。
4) 检测了重组表达蛋白 SK84-His6 的二级结构,发现 SK84-His6 可以形成两亲 性的 α 螺旋结构。
综上所述,通过原核表达可以获得具有一定活性的高纯度的 SK84 蛋白,此方 法提供了一种新的 SK84 获取途径,为今后的进一步研究奠定了良好基础。此外, 结构分析的结果提示,SK84 可能通过两亲性的 α 螺旋结构发挥抗菌作用。
关键词:SK84,抗菌肽,原核表达,纯化
II
II
Abstract
Antimicrobial peptides appear to be ubiquitous and multipotent components of the innate immune defense system used by both prokaryotic and eukaryotic organisms. The amphiphilic α-helix structure is important for their antimicrobial activity. Compared with traditional antibiotics, antimicrobial peptides have many advantages including wide antibacterial spectrum and low drug resistance, therefor, they might be developed into new drugs to defend microbial infection.
SK84 is a novel antibacterial peptide identified from the maggot by Dr. Lu Jie in 2006. SK84 can penetrate the cell membrane, resulting in the death of gram-positive bacteria. Additionally, SK84 inhibits the proliferation of HepG2, MCF-7 and MDA-MB-231.
It’s difficult to separate and purify SK84 from natural materials. In our study, SK84 was expressed and purified
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