草鱼Trap1基因克隆及其在草鱼呼肠孤病毒感染过程中的抗细胞凋亡作用-临床兽医学专业论文.docxVIP

上海海 上海海洋大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 何亚文 上海交通大学 教授 徐鸿绪 中山大学 教授 杨先乐 上海海洋大学 教授 赵金良 上海海洋大学 教授 谢骏 淡水渔业研究中心 研究员 答辩地点 上海海洋大学病原库 答辩日期 2015.06.02 摘 要 草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus，GCRV）是引发草鱼出血病的主要病原， 严重影响我国草鱼养殖行业的发展。GCRV 属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属 的双链 RNA 病毒，基因组分 11 个阶段，共编码 12 个蛋白。GCRV 能引起宿主细 胞基因转录水平和蛋白合成的变化，还会引起细胞融合、细胞凋亡等症状。细胞 凋亡是受基因调控的一种细胞程序性死亡形式，许多病毒能够诱导细胞凋亡，细 胞凋亡与病毒之间具有双向作用，宿主细胞能够通过细胞凋亡抑制病毒的感染， 而病毒能够通过细胞凋亡释放病毒粒子。 本文通过各种细胞凋亡检测技术对 GCRV 感染过程中 CIK 细胞的凋亡现象进 行了研究，通过 2-D 电泳、RACE、RT-PCR 等技术对草鱼 Trap1 基因进行了鉴定 分析，并对其在 GCRV 诱导的 CIK 细胞凋亡中的作用进行了初步探讨。主要包括 以下三个方面： （1）GCRV 诱导 CIK 细胞凋亡的检测。本研究主要通过不同方法检测 GCRV 感染 CIK 细胞过程中的细胞凋亡现象。用 MOI=10 的 GCRV 病毒感染 CIK 细胞 12 h 后，通过 DAPI 染色，检测到了明显的凋亡小体。用 MOI=1 的 GCRV 病毒感染 CIK 细胞 0、3、6、12、24、36、48 和 60 h 后，分别提取不同时间点的基因组 DNA， 然后通过凝胶电泳进行分析，结果显示，在感染 24 h 后能看到明显的 DNA 梯形条 带。TUNEL 检测试验也表明，用 MOI=5 的 GCRV 感染 CIK 细胞 12 h 和 24 h 后 都能检测到明显的凋亡信号。同时，RT-PCR 结果也表明，用 MO1=1 的 GCRV 感 染 CIK 细胞不同时间点后，细胞内的 Bax/Bcl-2 和 Caspase-3 表达量分别在 8 h 和 12 h 开始上调。此外，用 MOI=1 的 GCRV 病毒感染 CIK 细胞 12、24、36 和 48 h 后，膜联蛋白标记之后通过细胞分析仪进行细胞凋亡的定量检测，结果显示，在 病毒感染过程中细胞凋亡率逐渐上升并明显高于对照组。 （2）草鱼 Trap1 基因的蛋白组学鉴定、克隆表达及分析。本研究通过对 GCRV 感染 24 h 后与未感染的 CIK 细胞全蛋白进行双向电泳和质谱鉴定对比分析，结果 显示，蛋白点 1061 为草鱼 Trap1 蛋白，且病毒感染 24 h 后的草鱼 Trap1 蛋白表达 水平是未感染的 3 倍以上。进一步通过 RACE 扩增技术，得到了 2762 bp 的草鱼 Trap1 基因全长，包含 2157 bp 的开放阅读框，编码 718 个氨基酸。同源性分析结 果显示草鱼 Trap1 与斑马鱼 Trap1 同源性达到 87%。将 Trap1 基因插入到 pEGFP-N1 载体质粒后进行亚细胞定位实验，结果显示草鱼 Trap1 蛋白主要在细胞质中表达， 蛋白表达通过 Western Blot 实验进行验证。在 Poly(I: C)刺激和 GCRV 感染不同时 I 间点后，CIK 细胞中的 Trap1 基因转录水平均出现上调。 （3）草鱼 Trap1 基因调控病毒诱导的细胞凋亡。本研究为了探讨草鱼 Trap1 基因在 GCRV 诱导 CIK 细胞凋亡中的作用，先从草鱼 CIK 细胞 cDNA 中扩增出了 与 Trap1 相互作用并参与细胞凋亡调控的两个因子 PINK1 和 Sorcin 的基因片段， 并且在 GCRV 感染 CIK 细胞过程中，PINK1 和 Sorcin 的转录水平表达均上调。针 对 Trap1 基因，设计三条特异性的 siRNA，并通过 qRT-PCR 筛选出沉默效果较好 的 CiTrap1-siRNA2 进行下游实验。GCRV 感染 siRNA 处理后的 CIK 细胞，36 h 后定量检测细胞凋亡率，结果显示，siRNA 处理组细胞凋亡率明显高于未处理或 阴性 siRNA 处理组。 本研究通过不同方法检测 GCRV 感染 CIK 细胞的凋亡现象，结果表明 GCRV 能够诱导 CIK 细胞凋亡，然后通过双向电泳与质谱分析技术鉴定出了具有抗凋亡 作用的蛋白 Trap1，而后成功克隆得到了草鱼 Trap1 全长基因，并用 siRNA 基因沉 默方法初步证明了 Trap1 在 GCRV 感染 CIK 过程中起到